表达非洲猪瘟病毒p72抗原重组新城疫病毒的拯救及其免疫效果评价
作 者 : 陈新新
学位授予单位 : 中国农业科学院
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 殷宏
学位年度 : 2015
关键词 : 非洲猪瘟病毒；p72；新城疫病毒；病毒拯救；免疫评价
摘 要 : 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种出血性、高致死性疾病。自1921年在肯尼亚被发现以来,到目前为止已经传播到很多国家。近年来在高加索地区的流行尤其频繁,我国与俄罗斯接壤,边境地区的软蜱和野猪的存在使非洲猪瘟传入我国的风险加大。有关非洲猪瘟疫苗的研究很多,但至今仍没有商业化的疫苗可用。关于非洲猪瘟的免疫保护机制目前还不清楚,体液和细胞免疫在其中发挥的作用也各有说法。本研究利用反向遗传操作技术,以新城疫病毒作为载体,构建了表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗,并且在小鼠模型上从体液和细胞免疫反应两方面对其进行了评价。本研究首先在本实验室改造的新城疫病毒致弱株MG7的P和M基因之间引入Pme I酶切位点,将非洲猪瘟病毒的p72基因插入到MG7基因组的P和M基因之间。将全长克隆和辅助质粒通过脂质体转染法转染至重组痘病毒处理后的BHK-21细胞拯救出重组病毒,命名为r NDV/p72。从四个方面对重组病毒的生物学特性进行了鉴定:通过免疫印迹实验鉴定了非洲猪瘟病毒p72蛋白的表达;连续传代10次后经测序证实了p72基因稳定遗传;比较了该重组毒和亲本毒对鸡胚、雏鸡和小鼠的致病性以及在BHK-21细胞上的生长特性,外源基因的插入使得病毒的毒力降低,其在细胞上的生长能力也略有降低。进一步利用BALB/c小鼠模型对重组病毒的免疫效果进行了评价。将所述重组病毒r NDV/p72经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时设亲本毒对照组和PBS对照组;每隔两周进行一次免疫,共免疫四次。在第三次和第四次免疫一周后,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中诱导产生的p72特异性Ig G抗体以及Ig G亚型Ig G1和Ig G2a抗体的含量。四免二周后,取小鼠的脾脏分离淋巴细胞通过ELISOPT实验检测细胞因子IL-4和IFN-?分泌细胞的数量,同时利用细胞增殖实验评价其细胞免疫反应的强弱。ELISA结果显示三次及四次免疫后重组病毒免疫组p72特异性的Ig G抗体都可检测到,与对照组相比差异显著(p<0.05);且四免后的重组病毒免疫组Ig G抗体含量要高于第三次免疫,相比差异显著(p<0.05);Ig G1抗体的含量比Ig G2a高,Th2/Th1比率为6左右。IL-4和IFN-?分泌细胞数及细胞增殖幅度检测结果均为:重组病毒r NDV/p72免疫组高于亲本毒对照组,统计学分析,存在显著性差异(p<0.05)。综上,本研究获得的表达非洲猪瘟病毒p72基因的新城疫病毒活载体疫苗(r NDV/p72)不仅可以诱导小鼠的体液免疫反应,同时还可以很好地激发小鼠的细胞免疫反应,为非洲猪瘟的防治提供一种候选疫苗。
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