非洲猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增（RPA）方法的建立
作 者 : 哈登楚日亚
学位授予单位 : 内蒙古农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 吴树清;赵永刚
学位年度 : 2017
关键词 : 非洲猪瘟病毒；基础RPA；实时荧光RPA；侧流层析试纸条RPA
摘 要 : 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。由于ASFV的抗感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,阻止该病爆发主要依赖于早期快速诊断和预防。针对该现状,本研究成功建立了 ASFV重组酶聚合酶扩增技术(RPA)基础检测方法和重组酶聚合酶扩增技术(RPA)探针法检测方法,并从灵敏度、特异性、重复性、检测时间、检测温度等多方面进行分析,证实了基于RPA技术的核酸扩增方法具有敏感性强、特异性高、反应快速、恒温等特点。为建立重组酶聚合酶扩增技术(RPA)基础检测方法,根据GcnBank中ASFV基因序列FR682468,针对该序列p72基因区域设计三组基础RPA引物,优化反应时间、反应温度,进行灵敏度、特异性、稳定性试验,并检测样品。结果显示,本方法最佳反应条件为39℃C扩增20 min。灵敏度试验最低可检测到5.5 × 101拷贝/u L,与经典PCR方法灵敏度相同,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。结果表明,建立的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)基础检测方法可快速、灵敏、特异的检测ASFV。为建立重组酶聚合酶扩增技术(RPA)探针检测方法,本研究针对ASFV B646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示,实时荧光RPA方法可在39℃C、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应,检测5.5× 106-5.5× 100拷贝/μ L共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%-28.30%。侧流层析试纸条RPA最低可检测到5.5×101拷贝/μL浓度的质粒。目前,该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为我国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情爆发后相应控制方案的制定具有重要意义。
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