非洲猪瘟病毒实验室诊断技术研究及试剂储备
作 者 : 张鑫宇
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 孙怀昌
学位年度 : 2015
关键词 : 非洲猪瘟病毒；核酸纳米金扩增；重组伪狂犬病毒；重组抗原；间接ELISA；胶体金免疫层析
摘 要 : 非洲猪瘟(Afican swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种急性、高度致死性传染病。1921年,ASF最初发现于肯尼亚,上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。近几年来ASF流行范围有扩大趋势,已传播到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯联邦等我国周边国家,使我国养猪业面临严重威胁。由于ASFV感染机制复杂,目前没有疫苗用于防疫,因此快速、准确的诊断是控制该病传播和发生的关键。我国为ASF非疫区国家,国际参考实验室的一些诊断方法及试剂不仅来源有限、价格昂贵,而且不完全适合国内使用,因此开展相关ASF诊断技术研究并储备一定诊断试剂显得尤为必要。为此,本研究建立了ASFV核酸扩增纳米金检测、抗体检测间接ELISA以及胶体金快速检测试纸条,这对我国ASF防控具有重要意义。1.ASFV核酸纳米金扩增方法的建立根据22株ASFV p72基因序列比对分析结果,选择高保守区域序列设计PCR引物和核酸杂交探针,将烷巯基修饰的探针标记上纳米金颗粒,制备纳米金检测探针,并与生物素标记的捕捉探针一起加入PCR扩增的p72基因保守序列(大小651bp)进行杂交,杂交产物加入亲和素包被的反应板,用银染法进行信号放大,对反应条件进行系统优化,检测结果表明：杂交阳性产物在反应板中形成肉眼可见的黑色沉淀,检测目标序列的灵敏度达到10fmol/L。为了进一步提高反应的特异性,对100株不同基因型ASFV p72基因序列进行比对分析,选择p72基因高度保守(同源性为98%-100%)的1492-1908碱基区域为靶序列,设计通用PCR引物、捕捉探针和检测探针各两对,并将不同引物和探针进行组合,检测结果显示：双重PCR及探针组合的检测灵敏度可达到1 fmol/L。用建立的通用PCR引物、生物素标记的探针以及纳米金标记探针检测11株ASFV p72基因,同时设立猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对照,检测结果显示：不同基因型的11株ASFV核酸均为检测阳性,而PRV、PPV、PCV-2、CSFV和PRRSV核酸均为检测阴性,表明建立的ASFV核酸纳米金扩增法具有灵敏度高、特异性强的优点。为了进一步验证核酸纳米金扩增法检测组织细胞中ASFV的效果,以PRV Bartha K61基因组为模板,PCR扩增的TK基因同源臂以及GFP报告基因和ASFV p72基因表达盒,构建重组BAC转移载体,与PRV Bartha K61株基因组共转染PK-15细胞,经过多轮挑选荧光斑,获得了重组病毒rPRV-p72resc;以104TCID50剂量的重组病毒滴鼻感染ICR小鼠,24h后扑杀实验小鼠,提取心、肝、脾、肺、肾、脑、血液、小肠、肌肉等组织DNA,用建立的ASFV核酸纳米金扩增法检测p72靶基因,并用PCR方法进行验证,结果显示：两种检测方法的结果相符,提示建立的ASFV核酸纳米金扩增检测方法可用于感染组织中ASFV核酸的检测。2.检测ASFV抗体间接ELISA的建立为了获得用于ASFV抗体检测的重组抗原,分别将免疫原性强且序列保守的ASFV pA104R、pB602R、p54和pK205R基因插入原核表达载体pET-30a,构建的重组质粒pET30a-A104R、pET30a-B602L、pET30a-p54和pET30a-K205R转化BL21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表达产物,重组菌能表达预期大小的19KDa、75KDa、 21 KDa、25KDa重组蛋白。用镍柱亲和层析法纯化四种重组蛋白,以ASFV阳性血清进行Western-blotting检测,结果显示,四种重组蛋白均能与ASFV抗体发生特异性反应。用上述四种重组蛋白检测ASFV感染后不同时间的猪血清,发现pB602R、p54和pK205R具有较好的检测效果,在此基础上建立了多抗原检测ASFV抗体的间接ELISA (MA-ELSA),用该方法检测实验性感染ASFV的猪血清,其特异性为92.1%(95% CI,85.0%-96.5%),敏感性为98.2%(95% CI,93.8%-99.8%)；与OIE验证的ELISA (OIE-ELISA)以及两个商品化的ELISA试剂盒(ID Vet-ELISA、Ingenasa-ELISA)相比,120份Western blotting验证过的血清中,MA-ELISA符合率为93.3%(κ=0.86), OIE-ELISA符合率为88.3%(κ=0.74), Ingenasa-ELISA符合率为84.2%(κ=0.64), ID Vet-ELISA符合率只有66.7%(κ=0.18),分析MA-ELISA高符合率的原因,发现该检测方法能有效检测弱阳性的ASFV抗体。检测来自刚果的48份ASFV抗体阳性血清,结果进一步证实了MA-ELISA高准确性的特点。由此可见,建立的MA-ELISA检测效果良好,可替代传统的ASF血清学诊断方法。3. ASFV抗体胶体金快速诊断方法的建立用纯化的ASFV p54重组蛋白肌肉注射健康猪,每隔一周免疫一次,在第三次免疫后第7天采血分离血清,经间接ELISA检测证明抗体滴度达到105-6。在最适抗原用量为5μg、最佳标记pH为pH8.0条件下,用重组蛋白p54标记胶体金颗粒吸附玻璃纤维膜,以0.2mg/mL葡萄球菌A蛋白和1mg/mL抗p54多抗分别喷涂硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,按照一定的顺序组装成试纸条,建立了快速检测ASFV抗体的胶体金间接免疫层析方法。经检测,该试纸与CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2抗体阳性猪血清无交叉反应,检测敏感性和特异性良好；对141份猪血清比对检测发现,在ASFV感染早期,胶体金试纸优于OIE推荐的间接ELISA检测方法；以Western blotting检测方法作为参照,该试纸条检测疫区临床阳性样品的符合率更高。这表明本研究建立的ASFV抗体免疫层析检测方法具有特异、敏感等特点,在将来ASF防控上具有很好的应用前景。
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