非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其衣壳蛋白P72的原核表达
作 者 : 李维彬
学位授予单位 : 宁夏大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王玉炯;蒋正军
学位年度 : 2006
关键词 : 非洲猪瘟病毒；TagMan探针；实时荧光定量PCR；衣壳蛋白P72；原核表达
摘 要 : 本论文由两部分组成，一是非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立；二是非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达。主要试验和结果如下： 1.为建立一种快速、准确、特异的ASFV定量检测方法，根据TaqMan探针荧光定量分析原理，借助计算机辅助，对ASFV基因序列进行分析并利用Beacondisigner软件对检测引物和探针进行了优化筛选；利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的退火温度、镁离子、引物、探针浓度等参数进行了优化并对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估，同时通过对田间样品的检测对本方法的检测效果进行检验，建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法。经优化，荧光PCR反应中退火温度、Mg2+、探针和引物的最佳浓度分别为52℃、4.5mmo/L、500nmol/L和400nmol/L，最低检出量为102个拷贝数的质粒，特异性为100﹪，Ct值的CV小于5﹪。对送检的15份猪肉样品进行检测，结果全为阴性。上述结果表明，所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASF病毒核酸进行定量分析，从而为ASF的预防提供了一个更新、更为可靠的检测方法。 2.利用PCR技术，从含非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1.94kb的P72基因。将P72基因和表达载体pET-30c(+)分别用限制性核酸内切酶FhaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ进行双酶切，然后在T4DNA连接酶作用下，将P72基因定向克隆至载体pET-30c(+)中相应位点上，并转化至宿主菌BL21(DE3)中，得到了重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。经PCR鉴定，构建的重组菌株中含有P72基因。重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析，结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达，达到了菌体总蛋白的34﹪，表达产物的分子量约为78kD，并能被ASFV抗体所识别。
-
-
- 温馨提示：
- 在微信、微博等APP中下载时，会出现无法下载的情况
- 这时请选择在浏览器中打开，然后再请下载浏览
-
