阿托伐他汀对阿霉素心衰大鼠模型中Hsp70作用机制的研究.caj

阿托伐他汀对阿霉素心衰大鼠模型中Hsp70作用机制的研究
作者 : 高歌
学位授予单位 : 山东大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 隋树建
学位年度 : 2019
关键词 : 阿托伐他汀；心功能障碍；阿霉素；Hsp70
摘要 : 1、研究背景心力衰竭是由各种先天或后天心脏疾病引起的,逐渐导致持续的压力负荷和容量负荷加重而引起心肌收缩力下降、射血分数降低,最终导致血液动力学紊乱。这是心血管疾病的最终结果。心力衰竭容易导致心输出量减少,心肌收缩力减弱,代谢所需氧供失衡,进而导致各种心脏疾病。心力衰竭的发生涉及多种病理机制,包括免疫炎性细胞因子和神经免疫系统的激活以及心室结构的重塑等。其中,心室重塑是心力衰竭发生发展的重要环节。心室重塑包括心肌细胞损伤和心肌纤维化两方面。其中,心肌细胞损伤表现为心肌细胞肥大,坏死和凋亡,最终影响心脏功能。而心肌纤维化是一种瘢痕形成过程,其特征在于成纤维细胞的积聚和细胞外基质(ECM)蛋白的异常沉积,导致心脏的结构发生变化和心脏功能受到破坏。因此,对于心肌细胞凋亡和纤维化的靶向治疗可以从根本上减轻心力衰竭的进展。热休克蛋白(HSP)也称应激蛋白,是机体在一些应激原(如环境高温、缺血缺氧、氧化应激、创伤、感染)刺激下产生的一组高度保守的蛋白。其作为分子伴侣帮助蛋白质折叠并积极参与细胞应激,最大限度地减少对细胞组分造成的损伤。热休克蛋白包括结构型和诱导型两种蛋白。结构型热休克蛋白(cognate heat shock proteins,HSCs)在细胞的正常代谢和生理条件下表达和发挥作用,诱导型热休克蛋白(inducible heat shock proteins,HSPs)则在机体或细胞受到应激原刺激时表达迅速增加。根据分子量大小,HSPs可分为4个家族:Hsp90、Hsp70、Hsp60及小分子Hsp。其中Hsp70家族在生物细胞中含量最高,可诱导性最强,具有多种生物学功能。诱导型Hsp70显示出可以调节几种细胞内蛋白质(例如转录因子,酶和凋亡相关蛋白)和信号传导通路(例如c-Jun氨基末端激酶通路和细胞外信号调节激酶1/2通路),形成了一个复杂的网络,有助于减少活性氧的积累,维持钙离子稳态,抑制细胞凋亡,在抗心肌缺血性损伤和保护心脏功能中发挥着重要的作用。他汀类药物通过抑制脂质合成中的羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶,减少甲羟戊酸生成,减少胆固醇的合成,发挥降血脂和稳定斑块的作用,是目前临床上最常用的降脂药物和冠心病二级预防用药。此外,近年来大量研究还证实他汀类药物还具有除了调脂作用以外的其他作用,如改善血管内皮功能、抗氧化、抑制炎症细胞因子、抑制细胞凋亡、调节神经内分泌、保护心肌细胞等,显示出对心肌病和心衰等病人值得期待的治疗效果。此外,已有多项动物实验及临床研究也证实了,在各种缺血性或非缺血性心肌病以及心衰患者中,他汀类药物可以起到改善心功能、保护受损心肌、提高生存率的作用。尽管如此,他汀类药物对心力衰竭保护作用的确切机制仍不明确。2、研究目的本研究通过建立阿霉素心力衰竭大鼠模型,然后采用两种剂量的阿托伐他汀进行干预,研究了阿托伐他汀对心力衰竭大鼠组织学、心脏彩超中心功能指标和血清BNP的影响,以及对心肌组织中Hsp70、caspase-3、JNK、Akt、ERK等蛋白表达的影响,探讨阿托伐他汀对心衰的保护作用及可能的机制。3、研究方法总共32只8周龄(200±30g)雄性wistar大鼠用于本次实验。其中26只大鼠接受阿霉素(DOX)每周一次腹腔注射(2.5 mg/kg/w,ip),持续六周累积剂量为15mg/kg,正常对照组大鼠(n=6)接受等体积的生理盐水腹腔注射。在此过程中有3只接受阿霉素腹腔注射的大鼠死亡。最后一次腹腔注射阿霉素后间隔一周进行超声心动图检查,观察大鼠心脏结构及心功能变化,测量LVEDd,LVPWd,LVEF和FS,并抽血分离血清用以检测BNP及Hsp70。接受阿霉素腹腔注射的大鼠随后随机分为三组,分别接受为期4周的低剂量阿托伐他汀(20mg/kg/d)(DOX+LA)(n=8),高剂量阿托伐他汀(40mg/kg/d)(DOX+HA)(n=7)和等体积的生理盐水灌胃(DOX+NS)(n=8)。正常对照组大鼠接受等体积的生理盐水灌胃(control+NS)。4周后再次行心脏彩超评估心脏结构及心功能变化,测量LVEDd,LVPWd,LVEF和FS,并抽血分离血清用以检测BNP及Hsp70,随后处死所有大鼠。采用HE染色观察心肌组织病理形态学变化,免疫组化染色法和Western blot法比较各组大鼠Hsp70、Akt、ERK、JNK和caspase-3的表达,Masson染色法比较各组心肌纤维化程度,TUNEL法评估大鼠心肌细胞调亡比例。4、研究结果1.总体观察开始给药后每天观察大鼠的一般情况。DOX+NS组大鼠日常活动较前明显减少,且表现出精神不振,进食及饮水量较前明显减少,这些表现随着实验进行逐渐加重。DOX+LA组和DOX+HA组给药早期也出现了与DOX+NS组相同的症状,但是实验末期这些症状都有所好转。比较最终的死亡率,DOX+NS组8只大鼠中有2只死亡,DOX+LA组8只大鼠中有1只死亡,DOX+HA组7只大鼠中有1只死亡,四组比较差异均无统计学意义。2.阿托伐他汀对阿霉素诱导的心衰大鼠体重、心脏重量及心脏指数的影响control+NS组的大鼠体重呈稳定性增长,DOX+NS组大鼠体重明显下降,而DOX+LA组与DOX+HA组大鼠体重下降趋势显著低于DOX+NS组,但没有统计学差异。DOX+NS组大鼠的心脏重量高于control+NS组,而DOX+LA组与DOX+HA组大鼠心脏重量显著低于DOX+NS组,但差异仍然没有统计学意义。比较四组间心脏指数,DOX+NS组大鼠的心脏指数显著高于control+NS组,而DOX+LA组与DOX+HA组大鼠的心脏指数显著低于DOX+NS组,差异有统计学意义。3.阿托伐他汀对阿霉素诱导的心功能障碍和心脏结构性损伤的影响超声心动图检查结果显示,与control+NS组相比,DOX+NS组中LVEF和FS显著降低,LVEDd和LVPWd显著增加,差异有统计学意义。与DOX+NS组相比较,DOX+HA组LVEF和FS均有所改善,LVEDd和LVPWd均有所降低,差异有统计学意义,而DOX+LA组改善不明显。4.阿托伐他汀治疗对阿霉素处理后大鼠血清中BNP和Hsp70含量的影响与control+NS组相比,DOX+NS组血清BNP和Hsp70显着增高。与DOX+ NS组相比较,DOX+LA组和DOX+HA组BNP均有所降低,Hsp70均有所升高,且在Hsp的比较中,DOX+HA组较DOX+LA组改变更明显,差异有统计学意义。5.阿托伐他汀对阿霉素诱导的心肌细胞结构性损伤和心肌纤维化的影响control+NS组心肌结构正常。DOX处理后表现出心肌细胞膜损伤伴大面积心肌细胞坏死,明显的水肿和炎性细胞浸润。用阿托伐他汀治疗后可见显著的结构改善,表现为心肌细胞坏死的减少,水肿和炎性细胞浸润的减轻,其效果在40mg/kg/d时最显著。Masson染色结果表明,control+NS组存在极少的蓝色纤维,表明心肌间质纤维化不明显,而蓝色纤维在DOX+NS组显着增加并且分布不规则,表明心肌间质纤维化明显;应用阿托伐他汀治疗后蓝色纤维显著减少,纤维化程度减轻,且DOX+HA组改善更明显,差异有统计学意义。6.阿托伐他汀对阿霉素处理后大鼠Hsp70,p-Akt,caspase-3,p-JNK和p-ERK表达的影响Western blot结果表明,与DOX+NS组相比,阿托伐他汀(20mg/kg/d和40mg/kg/d)治疗后显著增加Hsp70表达。此外,阿托伐他汀显著降低DOX处理后大鼠中caspase-3表达。此外,我们观察到DOX+LA组和DOX+HA组中p-Akt的表达显着升高,而各组中Akt的表达没有任何显著变化。有趣的是,在四个组中,JNK和ERK的表达没有显著差异。然而,阿托伐他汀治疗降低了 DOX处理后大鼠p-JNK的表达。另外,阿托伐他汀使DOX处理后的大鼠中p-ERK的表达接近正常。所有的Western结果在免疫组化染色中也得到了证实。7.阿托伐他汀对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的影响在Western blot中,我们已经证实了在DOX处理后大鼠中,caspase-3表达显著增加,这个效应在TUNEL阳性细胞中也得到了证实,表现为DOX处理后大鼠TUNEL阳性细胞的增加。然而,用阿托伐他汀治疗后显著降低了 caspase-3的表达和TUNEL阳性细胞的诱导,且随着剂量的增加凋亡率改善更明显。5、研究结论1.通过观察大鼠的一般情况、心脏指数、超声心动图、血清BNP水平、组织病理学等指标证实,阿霉素能诱发大鼠心功能障碍。2.阿霉素诱导的大鼠心衰模型中p-JNK,p-ERK表达增加,结合Masson染色结果,提示心肌纤维化明显加重。3.阿霉素诱导的大鼠心衰模型中p-Akt表达减少,p-JNK和caspase-3表达增多,结合TUNEL染色结果,提示心肌凋亡明显增加。4.阿霉素诱导的大鼠心衰模型中Hsp70表达增加,反映了阿霉素诱导的心功能障碍刺激了 Hsp70的表达,用以保护心肌细胞。而阿托伐他汀治疗后Hsp70水平进一步升高,且随剂量增加Hsp70水平增高更明显。且这种改变伴随着p-JNK,p-ERK,caspase-3表达减少,p-Akt表达增多,提示阿托伐他汀治疗可抑制阿霉素诱导的心肌纤维化和心肌细胞凋亡,且这种保护作用可能是通过提高Hsp70水平而获得。