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RNA-Seq结合基因网络分析揭示水稻种子萌发的复杂调控过程
作者 : 魏婷
学位授予单位 : 中国科学院北京基因组研究所
学位名称 : 博士
导师姓名 : 胡松年
学位年度 : 2015
关键词 : 种子萌发；水稻；RNA-Seq；调控；网络分析
摘要 : 种子萌发一般是指从种子休眠到植株生长的一个过渡阶段,是植物新一轮生命周期的开始。水稻是世界上最重要的农作物之一,而且其全基因组序列早已公布,研究水稻种子的萌发有利于提高农业生产和后续研究。随着基因测序技术和“组学”的快速发展,全转录组测序成为了研究种子萌发的新工具,但至今仍缺乏相关研究。种子萌发的调控机制虽有相关报道,但对于萌发中多个调控因素共同调控的整个过程还有待进一步研究。为了从整个转录组水平研究水稻种子萌发的过程,我们基于新一代测序平台SOLiD,对粳稻日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)种子浸水0(干燥)、12和48(萌发)h(hour post imbibition,HPI)的胚进行了RNA-Seq研究。基于得到的83,273,725,71,036,373和90,085,278个reads,我們在0,12和48 HPI分別检測到了27,847,30,173和30,934个表达基因,这初步说明种子萌发过程中转录活动的增加。差异表达基因分析显示在萌发早期(0-12 HPI)发生显著变化的基因(6,911)明显多于后期(12-48 HPI)变化的基因(3,083),表明浸水前12 h是萌发过程中的重要阶段。基因功能分析表明萌发过程中发生了不同的分子生物学事件。例如,表观修饰、内部结构形态发生和碳水化合物结合相关基因分别在0,12和48 HPI富集。代谢分析表明萌发前期激活了基本的代谢活动,如淀粉相关代谢及细胞壁修饰相关基因表达量显著增加,有利于种子进一步吸水；后期脂类和氨基酸代谢以及光合作用代谢相关表达增加,为萌发后的植株生长作准备。水稻种子特异基因,尤其胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryo abundant,LEA),热激蛋白(heat shock protein 20,HSP20)及种子储存蛋白的编码基因,在萌发中表达量呈下降趋势。LEAs和HSPs在干燥种子中积累可以保护胚,在吸水后显著下降是适应环境的种表现。储存蛋白在吸水后被降解,可能为萌发过程和后期生长提供了代谢中间物和能量。植物激素在种子萌发中具有重要作用,但所有植物激素及它们之间的关系对萌发的整体调控尚未报道。本研究中,我们搜集了八种植物激素的合成和信号通路相关基因,包括脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)、油菜素内酯(brassinosteroid, BR)、乙烯(ethylene, ET)、细胞分裂素(cytokinin, CK)、生长素(auxin)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和水杨酸(salicylic acid, SA).植物激素相关基因表达量的增加/降低趋势某种程度上代表了植物激素对萌发的/正/负调控,表达谱分析结果证实ABA和GA为萌发的负调控和正调控激素,BR也可能为萌发正调控激素,另外几种植物激素的表达谱趋势不明显,不能预测其在萌发中的作用。为了研究植物激素之间的相互作用,我们进行了相关基因的共表达网络分析。网络前十个核心基因中有六个编码磷酸化相关蛋白,表明磷酸化在植物激素及萌发调控中的重要作用。比如,BR与ABA途径通过磷酸化相关的BR不敏感基因2(BR insensitive 2,BIN2)和蛋白磷酸酶2C基因(protein phosphatase 2C,PP2C)相连接,推测BR可能通过BIN2磷酸化PP2C从而抑制ABA的信号传导。其他植物激素如SA,可能与胁迫中的萌发过程相关。转录因子(transcription factor,TF)通过结合顺式作用元件(cis-element)调控基因转录。对收集的TF基因进行层次聚类,结果与整体基因的表达模式一致,可能在萌发中起调控作用。统计分析TF基因表达模式,可将TF分成三类在三个时间点富集的家族。根据共表达基因网络和GO分析,构建TF家族的功能网络,发现三类富集TF家族与该时期的功能变化密切相关。比如,0 HPI富集的PHD、SET和SNF2等TF家族与干燥种子中的表观修饰相关；12 HPI富集的HD-ZIP和M-type等家族与吸水后的内部结构形态发生相关;48 HPI富集的WRKY、AUX/IAA和NAC等家族与脂类代谢和光合作用相关。结合公共数据,我们在水稻胚中鉴定了35个萌发特异的TF基因。因为12 HPI表达量最高的基因即为最可能在萌发中起调控作用的基因,所以从中随机选取7个TF基因,进行qRT-PCR验证。实验结果基本与RNA-Seq数据表达模式一致,这为以后的功能实验研究提供了参考基因。顺式作用元件通过与TF结合调控基因的转录。我们统计了各时期高表达基因中富集的顺势作用元件,结果显示ABRE(ABA responsive element),GARE(GA responsive element)和光反应相关元件分别在0,12和48 HPI富集,这与ABA和GA相关基因的表达变化和萌发中的生理过程一致。总体来说,本研究分析了水稻种子萌发的转录组及功能变化,揭示了萌发是植物激素和转录因子等多种因素共同调控的复杂过程。结果同时表明磷酸化在植物激素相互作用中的重要性,并暗示了表观调控在控制种子休眠中的潜在作用。