基于非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的ELISA检测方法建立及应用
作 者 : 曹琛福
学位授予单位 : 华南农业大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 张桂红;花群义
学位年度 : 2016
关键词 : 非洲猪瘟；p54蛋白；抗原位点；酶联免疫吸附试验
摘 要 : 非洲猪瘟(African Swine Fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)引起的家猪和野猪出现一系列综合征的传染病,各年龄段猪只均可发病。急性症状以高热、网状内皮系统出血及高死亡率为特征。2007年后传入东欧及高加索地区,呈现地方流行的态势。目前普遍担心由于国际贸易活动的增加以及养殖猪只数量的增长,非洲猪瘟可能会穿越欧洲进入亚洲,特别是东亚。世界动物卫生组织(OIE)将非洲猪瘟列为法定报告的动物疫病,而在我国动物疫病病原微生物名录中也列为一类动物疫病。当前的动物疫病诊断技术中,ELISA方法因其具有敏感、特异、快速和易于标准化等特点,且可以使用自动化检测设备,从而更适合于大量动物群体样本检测的需要,是当前在动物疫病的检疫和监测中应用最为广泛的血清学检测技术,基于ELISA技术的试剂盒仍然是当前国内外动物疫病诊断试剂市场的主要产品,市场需求及应用前景巨大。本研究首先筛选非洲猪瘟疫病病原重要靶标基因和重组抗原,制备特异性单克隆抗体,建立我国自主知识产权的非洲猪瘟疫病抗原和抗体试剂,研发非洲猪瘟重要外来动物疫病新型诊断技术产品,以期有效防止外来疫病传入我国,及时准确地掌握进出境贸易中疫情疫病状况。研究利用pET-52b(+)原核表达系统成功将非洲猪瘟病毒特异性P54蛋白实现可溶性表达,纯化后,经免疫印迹试验证实P54重组蛋白具有反应原性,可作为建立体外诊断方法所需要的抗原。研究还将非洲猪瘟病毒P54基因成功导入杆状病毒,通过感染Sf9昆虫细胞获得重组蛋白P54的真核细胞表达载体,SDS-PAGE电泳试验结果表明其表达量较低,也未能获得纯化的目的蛋白。免疫印迹试验证实真核细胞表达的重组蛋白P54具有较好的反应原性,可用于本研究在单克隆抗体制备时的抗原筛选。研究分析了非洲猪瘟病毒P54蛋白二级结构,推测非洲猪瘟病毒P54蛋白可能含有6个B细胞抗原表位。通过间接ELISA方法证实,该6处抗原位点可以与非洲猪瘟病毒阳性血清发生特异性结合。分析发现了一处保守性位点,因此在制备单克隆抗体时进行了有针对性的筛选,获取特定抗原位点的单克隆抗体。研究用原核表达系统表达的重组P54蛋白免疫小鼠后,经证实其具有良好的免疫原性,并挑取了血清抗体水平高的小鼠,取其脾细胞作细胞融合。又利用原核表达系统表达的重组蛋白P54、真核表达系统表达的重组蛋白P54以及人工合成特定序列的抗原表位多肽三种筛选方法,获取了2株特异性强、背景清晰的杂交瘤细胞株,且2株杂交瘤细胞株针对不同的抗原位点,目前均已保存在中国典型培养物保藏中心,编号为CCTCC NO:C2014212和CCTCC NO:C2014213。研究采用美国伯乐ProteinOn XPR36蛋白质大分子相互作用系统,利用蛋白质表面等离子体共振光学生物传感技术对获取到的1株单克隆抗体2E4与预测的多条非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原位点多肽进行相互作用,结果成功获取并验证了非洲猪瘟病毒P54蛋白中一处保守抗原位点,并解析了该位点构成的最小必须氨基酸个数和序列。将该段氨基酸序列与NCBI数据库中所有非洲猪瘟P54蛋白氨基酸序列(共197条)进行BLAST比较,结果发现该段氨基酸序列在目前世界流行的非洲猪瘟病毒株中非常保守,因此其对应的单克隆抗体是建立检测非洲猪瘟抗体竞争ELISA方法的理想蛋白。本研究筛选出ELISA最佳包被抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒P54蛋白,其最佳包被浓度为2.5μg/mL,并利用本研究获取的2E4单克隆抗体作为竞争性酶标单抗,优化了竞争ELISA方法实验条件和实验流程,确定了结果判定阈值,建立了检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争ELISA方法。该方法采用的酶标单抗所针对的抗原位点非常保守,理论上能检测到世界目前所有流行非洲猪瘟病毒株的阳性血清。同时该方法特异性强,达到100%;灵敏度高,可达96.22%;与西班牙INGENASA公司生产的检测非洲猪瘟竞争ELISA试剂盒的符合率可达到98.13%。临床应用中,检测了1574份猪血清田间样本,结果均为阴性。研究为有效防止非洲猪瘟病毒传入中国,及时掌握进出境贸易中疫情疫病状况,提供了准确、可靠且具有自主知识产权的抗体检测方法。本研究建立的竞争ELISA方法已成为深圳市市场监督管理局标准化指导性技术文件《非洲猪瘟病毒抗体检测阻断酶联免疫吸附法》(SZDB/Z 131-2015),并于2015年3月发布实施。可为深圳市乃至全国防范非洲猪瘟的传入提供技术支持。
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