非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建
作 者 : 杨晓红
学位授予单位 : 华中农业大学
学位名称 : 硕士
外文题名 : Preparation of Monoclonal Antibodies Against P72Gene of African Swine Fever Virus and Construction of the Recombinant Baculovirus
导师姓名 : 曹胜波
学位年度 : 2012
关键词 : 非洲猪瘟病毒；P72基因；单克隆抗体；杆状病毒
摘 要 : 非洲猪瘟(African Swine Fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大,被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入,却时刻面临传入的风险。因此,开展该病诊断方法和疫苗的储备性研究,对于该病的防范具有重要意义。本研究利用原核表达的ASFV P72蛋白作为免疫原,制备了P72蛋白的单克隆抗体,并构建了P72基因的重组杆状病毒,为非洲猪瘟的诊断方法和免疫预防等研究奠定了基础。具体研究内容如下：1.P72基因的原核表达及其单克隆抗体的制备根据已发表的序列,设计合成了ASFV P72基因,并将其克隆至原核表达载体pGEX-KG,得到重组原核表达质粒pKG-P72。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测证实,P72蛋白以可溶性形式在大肠杆菌中获得了高效表达。以纯化的P72蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,并通过细胞融合和间接ELISA方法筛选,获得了5株能稳定分泌针对P72蛋白的特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1E1、1F3、3F1、3D11、4F10,单抗亚类鉴定均属于IgG2a。经间接免疫荧光和Western Blot分析,获得的5株单克隆抗体均能与P72原核和真核表达蛋白发生特异性反应。2.P72基因重组杆状病毒的构建在构建真核表达质粒pcDNA-P72的基础上,用BglⅡ+XbaⅠ双酶切该质粒,获得CMV-P72表达框,并将其插入到转移载体pFast-VSV-G中,得到重组转移质粒pFast-G-P72。将该转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态,通过蓝白斑筛选得到阳性重组穿梭载体Bacmid-G-P72。将提取的重组Bacmid-G-P72DNA转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-G-P72。将重组杆状病毒转导EPC细胞,并通过间接免疫荧光实验和Western Blot分析,证实P72基因在真核细胞中得到了表达。
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