基于逆向相变和自裂解的重组蛋白表达和纯化系统的建立与应用

基于逆向相变和自裂解的重组蛋白表达和纯化系统的建立与应用
作者 : 刘文俊
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 孙怀昌
学位年度 : 2014
关键词 : 类弹性蛋白；自剪切元件；融合表达载体；重组蛋白制备
摘要 : 重组蛋白表达是蛋白功能研究、药物研发等研究领域的重要环节,但目前重组蛋白的纯化面临巨大挑战。常用的重组蛋白纯化方法主要有亲和层析法,其基本原理是将目的蛋白与某种标签蛋白进行融合表达,然后利用特定配体偶联的亲和柱纯化融合蛋白,其优点是纯化效率较高,但不仅需用昂贵的亲和树脂,难以规模化制备,而且通常需用蛋白酶切除标签蛋白,才能获得有活性的目的蛋白。然而,所用蛋白酶不仅价格昂贵,而且需用其他方法将其从终产物中去除,这不仅使重组蛋白纯化进一步复杂化,而且额外增加制备成本。因此,建立简单、经济的重组蛋白纯化方法是生物制药研究领域迫切需要解决的问题,对兽用重组蛋白更是如此。类弹性蛋白(elastin-like polypeptides, ELP)具有逆向温度相变特性,其融合蛋白能随溶液温度或盐浓度改变从可溶性状态变为不溶性状态,因此可用离心、超滤等简单、快速、经济的方法进行融合蛋白分离,且便于规模化制备。蛋白内含肽(intein)等自加工元件(self-processing module, SPM)具有可诱导水解活性,能在温度、pH、盐离子等诱导下将功能蛋白从前体蛋白上切割下来,因此能用于融合标签蛋白的裂解和目的蛋白的释放。因此,将ELP逆向相变特性与SPM自裂解活性相结合,建立的重组蛋白表达与纯化系统不仅可大大简化重组蛋白的纯化,而且能显著降低生产成本。本研究先利用ELP-内含肽融合表达系统,成功表达和纯化得到人防御素3(human βdenfesin3, HBD3)和非洲猪瘟病毒K205R蛋白,然后构建ELP与脑膜炎奈瑟球菌FrpC蛋白SPM融合表达载体,并以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、猪IgGFc片段(Fc portion of porcine IgG, pFc)和HBD3代表不同结构和分子量的目的蛋白,对融合蛋白的分离纯化和目的蛋白的裂解释放等条件进行了系统的优化,研究结果如下：类弹性蛋白和AI-CM内含肽介导的人防御素3的表达与纯化：将HBD3成熟肽编码序列直接插入引进的ELP与ΔI-CM内含肽融合表达载体,将重组质粒pET-EI-HBD3转化BLR大肠杆菌,在20℃C利用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下利用ELP的温度敏感逆向相变循环(ITC)纯化融合蛋白,以内含肽自体裂解特性释放目的蛋白,用琼脂扩散法和最小抑菌浓度法测定重组HBD3抗菌活性。结果显示：融合蛋白EI-HBD3在重组大肠杆菌中获得可溶性表达,第一轮ITC获得的融合蛋白的纯度为85.7%,再次ITC后的纯度达93.1%；内含肽介导的融合蛋白自体裂解温度为28℃,孵育12h的裂解效率达90.3%,重组HBD3的回收率达74.8%,产量为0.98mg/L,纯度为92.6%；重组HBD3的内毒素含量<0.03EU/mg蛋白,对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌具有显著的抑菌活性。这些研究结果表明：基于ELP逆向相变循化和内含肽自体裂解的重组蛋白表达与纯化系统可用于重组HBD3的规模化制备。类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒K205R的表达与纯化：用限制酶消化法将ELP编码序列从pET-EI-GFP载体上切下,克隆入原核表达载体pET-30a的EcoRV/SacI位点；以pTWIN1质粒载体为模板,用PCR扩增Mxe内含肽编码序列,将其与上述载体中的ELP编码序列融合,获得融合表达载体pET-MIE。用PCR扩增非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因,插入pET-MIE载体,用重组载体pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,在低温下用IPTG诱导融合蛋白表达,利用ITC进行融合蛋白纯化,对Mxe内含肽的自裂解条件进行优化。结果显示：在20℃C条件下表达的融合蛋白K205R-MIE为可溶性产物,在26℃进行ITC融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。类弹性蛋白与自加工元件融合表达系统的建立：用生物信息学软件将脑膜炎奈瑟球菌FrpC蛋白的SPM编码序列优化成大肠杆菌偏爱序列,在其上、下游分别添加NdeI、EcoRI、 Sall等的多克隆位点和VspI酶切位点,将合成序列与ELP基因片段融合,插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pSPM-ELP。根据GFP序列设计引物,将PCR扩增产物插入pSPM-ELP载体,获得重组载体pGFP-SPM-ELP,用酶切法和测序法对重组载体进行鉴定。将pGFP-SPM-ELP转化BLR大肠杆菌,在终浓度为0.5M的IPTG诱导下,20℃培养24h,融合蛋白获得高效可溶性表达。相变温度测定结果显示：GFP-SPM-ELP融合蛋白的相变温度为28℃。取重组菌裂解物离心上清进行两轮ITC,结果显示第一轮和第2轮ITC获得的融合蛋白纯度分别为75.1%和89.2%；自裂解条件优化结果显示：GFP-SPM-ELP融合蛋白的最佳切割条件为5mM Ca2+、10mM DTT、24℃和12h。在自裂解后进行另一轮ITC,获得的重组GFP能在紫外线激发下产生典型的绿色荧光,内毒素含量<0.03EU/mg,蛋白产量为36mg/L,回收率为90%,纯度为100%。这些研究结果说明,本研究构建的SPM-ELP融合表达系统可以用于重组蛋白的表达与纯化。类弹性蛋白和自加工元件介导的猪IgG Fc片段的表达与纯化：根据猪IgG Fc片段编码序列设计引物,上、下游引物上分别添加EcoRI和SalI酶切位点,以pShuttle-Fc质粒为模板进行PCR扩增,将扩增片段并插入pSPM-ELP载体,获得重组载体pFc-SPM-ELP,用酶切及测序法对重组载体进行鉴定。将重组质粒pFc-SPM-ELP转化BLR大肠杆菌,在20-C条件下用0.5M IPTG诱导表达24h, SDS-PAGE分析结果显示：融合蛋白Fc-SPM-ELP的可溶性良好。Tt测定结果显示：融合蛋白Fc-SPM-ELP的相变温度为26℃。取重组菌裂解物离心上清进行两轮ITC,获得的融合蛋白纯度分别为77.9%和90.4%。在优化条件下进行融合蛋白自切割,最后1轮ITC获得的纯化Fc的内毒素含量<0.03EU/mg蛋白,蛋白产量为11.5mg/L,回收率为64%,纯度为90%。这些研究结果进一步证明本研究构建的SPM-ELP融合表达系统可以用于重组蛋白的表达与纯化。类弹性蛋白和自加工元件介导的人防御素3的表达与纯化：用生物信息学软件将HBD3成熟肽序列优化成大肠杆菌偏爱序列,上、下游分别添加NdeI和SalI酶切位点,将合成的基因片段并插入pSPM-ELP载体,获得的重组载体pHBD3-SPM-ELP经酶切及测序鉴定正确。将pHBD3-SPM-ELP转化BLR大肠杆菌,在20℃条件下用0.5M IPTG诱导表达24h。SDS-PAGE分析结果显示表达的融合蛋白HBD3-SPM-ELP的可溶性良好。Tt测定结果显示：融合蛋白HBD3-SPM-ELP的相变温度为28℃。取重组菌裂解为离心上清进行两轮ITC,获得的融合蛋白的纯度分别为36.0%和42.6%。在优化条件下进行融合蛋白自裂解,再经1轮ITC获得纯化HBD3,其内毒素含量<0.03EU/mg,蛋白产量为1.1mg/L,,回收率为89%,纯度为94%。抑菌试验结果显示：重组HBD3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抗菌活性,对金黄色葡萄球菌(ATCC26003)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(K12-MG1655)和大肠杆菌(ATCC44102)的最小抑菌浓度分别为12.5μg/mL、100μg/mL、25μg/mL和50μg/mmL。这些研究结果说明,SPM-ELP融合表达系统可用于HBD3的表达与纯化,纯化的重组蛋白保持天然蛋白的抗菌活性。总之,本研究进一步证明基于ΔI-CM内含肽和ELP的重组蛋白表达系统可以用于HBD3等重组蛋白的表达和纯化,成功构建基于Mxe内含肽和ELP的重组蛋白表达与纯化系统,并获得了非洲猪瘟病毒K205R重组蛋白：首次成功构建基于ELP和SPM的重组蛋白表达与纯化系统,系统优化了融合蛋白纯化及自裂解条件,获得了GFP、Fc和HBD3等分子量、结构不同的重组蛋白,有望用于兽用重组蛋白的规模化生产。