TOPK在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究

TOPK在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究
作 者 : 刘妮妮
学位授予单位 : 华中科技大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 孙军
学位年度 : 2018
关键词 : TOPK；Apoptin；肿瘤；凋亡；磷酸化
摘 要 : 目的:探讨肿瘤细胞中TOPK对Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡效应的影响;明确TOPK对Apoptin的磷酸化作用,并初步判断其磷酸化位点。方法:1.采用质粒大提的方法,制备慢病毒包装所需质粒、pcDNA3.1、pcDNA3.1-HA-TOPK真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。2.培养多种人肿瘤细胞,Western Blot检测TOPK表达水平,选择TOPK表达水平不同的HCT116、SGC7901和HepG2细胞进行后续实验。将P4A蛋白与上述细胞孵育,采用下列方法检测肿瘤细胞对P4A的敏感性:MTT检测P4A蛋白对细胞增殖活性的影响;Western Blot检测凋亡相关蛋白c-caspase3的表达。3.在TOPK高表达的HCT116、SGC7901细胞中,采用慢病毒介导的sh RNA沉默技术,建立TOPK沉默细胞系。Western Blot检测TOPK表达水平鉴定沉默效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,通过与sh Mock组对比,研究沉默TOPK表达对P4A蛋白诱导HCT116、SGC7901细胞凋亡的影响。4.在TOPK低表达的HepG2细胞,通过脂质体转染的方法实现TOPK过表达。Western Blot检测TOPK表达水平鉴定转染效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,检测过表达TOPK对P4A蛋白诱导HepG2细胞凋亡的影响。5.采用活化的TOPK为激酶、纯化的P4A蛋白为底物,开展体外激酶实验,研究TOPK对Apoptin蛋白的磷酸化作用。利用Net Phos2.0软件分析Apoptin序列中Ser、Thr位点,筛选出分值较高者的位点,合成肽段。采用活化的TOPK和肽段,开展体外激酶实验,研究TOPK对不同肽段的磷酸化作用,初步确定Apoptin序列上TOPK的磷酸化修饰位点。结果:1.将慢病毒包装所需质粒转染到293T细胞中,成功获得慢病毒。提取pcDNA3.1、pc NDA3.1-HA-TOPK真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。2.Western Blot检测,TOPK在HCT116、SGC7901细胞呈高表达;在Hela细胞中呈中等程度表达;在MKN45、HepG2细胞中呈低表达。孵育P4A蛋白后,HCT116、SGC7901、HepG2细胞的增殖活性较未处理组相比显著下降,凋亡相关蛋白c-caspase3的表达水平也显著升高。说明P4A蛋白诱导上述细胞发生凋亡。3.Western Blot结果表明,在结肠癌细胞HCT116以及胃癌细胞SGC7901中TOPK基因沉默细胞系建立成功。孵育P4A蛋白后,MTT结果显示sh TOPK组细胞增殖活性要明显高于sh Mock组;两种细胞的sh TOPK组的c-caspase3的表达水平较sh Mock组相比都有明显的降低。说明沉默TOPK的表达,P4A蛋白对SGC7901、HCT116细胞的凋亡诱导效应降低。4.在TOPK低表达的HepG2细胞中,转染pcDNA3.1-HA-TOPK质粒,TOPK的表达水平明显升高,表明转染成功。与未孵育P4A蛋白组相比,孵育P4A蛋白组细胞的增殖活性显著降低,而其c-caspase3的表达水平显著升高,说明P4A蛋白能够诱导HepG2细胞发生凋亡。但是转染TOPK表达组细胞在孵育P4A蛋白后,细胞增殖抑制率以及c-caspase3的表达水平要明显高于单独孵育P4A蛋白组。说明上调TOPK的表达,P4A蛋白对HepG2细胞的凋亡诱导效应升高。5.体外激酶实验证明TOPK可以直接磷酸化P4A蛋白,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。结论:在TOPK高表达的HCT116、SGC7901细胞中,沉默TOPK的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应降低;在TOPK低表达的HepG2细胞中,上调TOPK的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应升高。体外激酶实验证明:活化的TOPK可以直接磷酸化P4A,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。

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