鸡MD肿瘤相关基因及IncRNAs的筛选与验证分析

鸡MD肿瘤相关基因及IncRNAs的筛选与验证分析
作 者 : 马大川
学位授予单位 : 沈阳农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 汉丽梅
学位年度 : 2017
关键词 : lncRNAs；转录组；MD；肿瘤；鸡
摘 要 : 马立克病毒（Marek’s disease virus,MDV）是禽类疾病众多病原体中重要的一种,其中致病性MDV-1型可导致鸡发生恶性传染病,其特征是严重免疫抑制和T淋巴细胞瘤。由MDV引起的鸡马立克氏病（Marek’sdisease,MD）肿瘤是理想的病毒性肿瘤研究和治疗的动物模型。在对许多肿瘤的研究发现长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs,lncRNAs）具有异常表达的现象,上调或下调的lncRNAs出现在肿瘤发生的各个阶段,对肿瘤的形成和发展可能起到一定的促进或是抑制作用。本研究首先应用MD脾脏肿瘤和正常脾脏组织RNA-Seq获得的数据库,通过对其中的差异表达基因数据库、信号通路数据库和基因互作数据库等进行分析,筛选与肿瘤相关的差异表达基因,并对其中重要的差异表达基因进行实验验证,探讨其在MD肿瘤形成过程中的表达情况和功能。分析结果表明:（1）共有499个差异表达基因被注释到了 256个信号通路中,与肿瘤相关的6个信号通路呈现显著性差异（P<0.05）,其中肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）与肿瘤发生相关显著性最高（P＜0.05）。（2）在MD肿瘤组织中,mRNA水平上,表达上调的细胞因子信号转导抑制因子SOCS1和SOCS3基因,在基因调控网络中处于核心位置,对下游炎症相关因子起到抑制作用,影响肿瘤发生的进程;同时SOCS1和SOCS3和基因的表达也受到上游表达上调的NF-κB和信号传导及转录激活因子STAT1和STAT3基因的调控,这两类调控因子均可促进肿瘤的形成。通过对筛选出的基因进行qPCR验证结果表明:与对照组相比,MDV感染组筛选到的5个基因均呈现出上调表达,这与RNA-Seq预测分析的结果一致,说明RNA-Seq结果真实反映了 MD肿瘤形成过程中差异基因的表达情况。其次,以新lncRNAs数据库作为分析数据来源,应用编码潜力计算工具（Coding Potential Calculator,CPC）、编码潜力评估工具（Coding Potential Assessment Tool,CPAT）、序列比对工具（blastx）和Ensembl中的BLAST/BLAT等在线分析工具,对新lncRNAs数据库中的条目进行蛋白编码能力的进一步交叉验证分析,从中筛选与MD肿瘤发生相关的lncRNAs。分析结果获得6425个具有较低编码能力的新lncRNAs。其中筛选到 TCONS00025968、TCONS00032120、TCONS<sub>00036544、TCONS00009801、TCONS00009802和TCONS00009803六个lncRNAs可能与肿瘤抑制基因p53的表达有关。应用鸡MD动物模型,在MDV感染的第1、21、35和42日龄,检测了鸡脾脏组织样本p53 基因和 TCONS<sub>00009801、TCONS00009802 和 TCONS00009803 三个lncRNAs的转录水平,通过与同日龄的正常鸡脾脏比较,结果表明:（1）MDV感染后,p53基因和TCONS<sub>00009801的转录水平呈一致性变化趋势,在1～35日龄期间均呈现上升趋势,在42日龄时下降,表明在MDV入侵早期,两者可能存在协同作用。随MDV在宿主体内时间的延长,lncR:NA-TCONS00009801和p53表达下调,可能与细胞凋亡功能紊乱及细胞的永生化趋势有关。（2）MDV感染后随日龄的增大,TCONS00009802和TCONS<sub>00009803转录水平呈逐渐上升趋势,其在21日龄时与1日龄差异不显著（P>0.05）,与35日龄、42日龄差异极显著（P<0.01）。在正常鸡脾脏中则呈现先上升后下降趋势,且两个lncRNAs随鸡日龄增大变化均不显著（P>0.05）。在MDV感染后,鸡脾脏组织的lncRNA-TCONS00009801与p53基因的转录表达趋势呈一致性先上调后下调的变化;但TCONS<sub>00009802和TCONS00009803随鸡日龄的增大转录水平持续上调,而p53基因同期转录水平在1～35日龄先上调,而后在42日下调的趋势不一致,该三个lncRNAs对p53基因的转录表达可能具有不同的作用,其对p53功能的影响还需要进一步的探讨。p53基因以及三个lncRNAs在除1日龄外的其余三个日龄阶段试验组与对照组表达量差异均极显著（P<0.01）,在42日龄时,以上三个lncRNAs的转录水平与RNA-Seq预测分析结果一致,说明RNA-Seq结果真实反映了 MD肿瘤形成过程中lncRNAs的转录情况。本研究获得的MDV诱发的肿瘤组织转录组信息及相关基因转录水平的差异表达,为病毒性肿瘤发生机制的研究提供了有价值的参考。

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