CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装

CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装
作者 : 罗忠永
学位授予单位 : 四川农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王印;岳建国
学位年度 : 2017
关键词 : CSFV；HP-PRRSV；ASFV；PEDV；GeXP多重PCR
摘要 : 研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装GeXP多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室其他类似课题研究成果,最终建立基于GeXP技术的猪体重要疫病的高通量诊断技术。研究方法:1、选定核酸作为病原诊断的指示物,参考病原全基因组序列比对分析研究成果,遵循特异保守的原则,选定CSFV5UTR序列、HP-PRRSVNSP2基因、ASFV B646L基因、PEDV M基因作为核酸检测区段;从NCBI数据库下载各病原相应核酸序列,使用生物学软件比对分析根据毒株间保守区域设计引物;特别地,设计的HP-PRRSV诊断引物要能区分PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株。2、根据实验设计的引物建立单病原PCR诊断方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析单病原单重PCR的特异性;利用体外转录合成的CSFV、HP-P RRSV、PEDVRNA标准品和构建的ASFV质粒分析单病原单重PCR的灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析引物设计是否符合设计预期。3、以鉴定符合设计预期的引物,参考GeXP实验指导建立本研究的4种病原GeXP多重检测方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析4种病原GeXP多重检测方法的特异性;通过RNA标准品和质粒分析4种病原GeXP多重检测方法的单病原和多病原灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析本实验建立的4种病原GeXP多重检测方法的可行性。4、根据实验成果组装GeXP多重检测试剂盒,使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;以单病原检疫标准方法作为参考,分析本实验组装的试剂盒的相对特异性、相对灵敏度、符合率;根据实验结果分析该试剂盒的临床应用价值。结果:1、单病原单重PCR实验结果显示本实验设计的引物能特异性地检出CSFV、H P-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMDV、PP V、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;各病原单重PCR的灵敏度为102copies/μl;根据HP-PRRSV NSP2基因缺失区设计的引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;本实验设计的引物符合实验预期,能够用于GeXP多重检测方法的建立。2、根据GeXP实验指导建立的4种病原GeXP多重检测方法能够特异性地检出CSFV、HP-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMD V、PPV、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;设计的HP-PRRSV引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;GeXP多重检测方法的单病原检测灵敏度在102copies/μl～103copies/μl之间,GeXP多重检测方法的多病原检测灵敏度为103copies/μl;本实验建立的GeXP多重检测方法具有很好的特异性和灵敏度,可以用于组装GeXP多重检测试剂盒,探究临床应用价值。3、基于结果3组装GeXP多重检测试剂盒;使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;本实验组装的GeXP多重检测试剂盒的相对特异性和相对灵敏度均为100%,符合率为97%～100%。结论:本实验成功建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原GeXP多重检测方法,组装了检测试剂盒;通过对临床病料的检测及与单病原检疫标准方法对比证实该试剂盒具有很好的临床应用价值。