AP1复合体在HCV感染过程中作用的机制研究

AP1复合体在HCV感染过程中作用的机制研究
作者 : 李响
学位授予单位 : 北京协和医学院
学位名称 : 博士
导师姓名 : 杨威
学位年度 : 2015
关键词 : 适配蛋白复合体1；丙型肝炎病毒；E6AP；E2；Core
摘要 : 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)目前已导致全球约1亿5千万人感染,并可能进一步发展为肝硬化或肝癌等疾病。病毒的生命周期依赖于病毒与宿主因子的相互作用。目前,关于HCV与宿主相互作用的研究主要集中于病毒入侵和复制阶段,主要针对病毒受体和复制必须因子等,而对病毒生命周期晚期阶段的研究则相对较少。随着人类功能基因组筛选技术的成熟,越来越多的病毒相关宿主依赖因子通过此技术被发现并确认,为了进一步研究HCV生命周期所必须的宿主因子,本研究利用人类50k shRNA库,对HCV感染相关宿主基因进行了系统化筛选,并获得了206个候选基因。通过对候选基因的功能学鉴定,我们发现干扰AP1复合体西格玛3亚基(adaptor-related protein complex 1 sigma 3 subunit, AP1S3)的抗病毒效果明显并且稳定。AP1属于AP家族,是一个异四聚体蛋白复合体(两个大亚基、一个中亚基和一个小亚基),在细胞中识别分选信号,并组装成转运小泡,在细胞内各细胞器之间扮演着重要的物质运输作用。不同的AP复合体负责不同的转运路径,AP1主要在反式高尔基体(trans Golgi network, TGN)和内体之间运输,而AP2则主要在细胞内吞作用时发挥作用。许多病毒会劫持AP1复合体的胞内运输功能,以利于自身的组装和出芽,包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)和非洲猪瘟病毒(african swine fever virus, ASFV)。为了进一步验证AP1S3调节HCV生命周期的作用,我们使用了Jcl-Luc HCVcc和JFH-1 HCVcc对其进行了评价,发现干扰AP1S3具有良好的抗病毒效果。进而我们使用了HCV假病毒系统(HCVpp)、HCV复制子系统(2-3+)和HCV组装释放系统对AP1S3参与病毒生命周期的具体环节进行了鉴定。研究结果显示,AP1S3主要在HCV生命周期晚期阶段发挥作用,敲低AP1S3能够显著降低HCV子代病毒的产生,并且发现敲低AP1复合体的其他亚基也具有类似的作用。为了揭示AP1参与病毒调控的机制,本研究通过免疫共沉淀实验发现AP1能够通过两个经典的模体,YXXΦ和(D/E)XXXL(L/I),与HCV的两个结构蛋白core和E2相互作用。通过这两组模体所介导的相互作用,AP1能够保护core和E2免于蛋白酶体的降解。干扰AP1会导致core和E2蛋白泛素化程度的增加。进一步的体内外泛素化实验显示,作为E3泛素连接酶,E6相关蛋白(E6 associated protein, E6AP)能够介导core和E2的泛素化过程。为了鉴定干扰AP1是否能够引起其他病毒蛋白表达量的下降。我们选取了4种病毒包膜蛋白进行AP1相关的包膜蛋白降解实验,包括日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)、埃博拉病毒(Ebolavirus, EBOV)和流感病毒(influenza virus)。研究结果发现敲低AP1复合体能够抑制EBOV和流感病毒包膜蛋白的表达量,可能与糖基化修饰程度相关。同时,我们根据AP1-core/E2相互作用,设计合成了一个融合短肽,将TAT穿透肽、core的YXXΦ模体序列和E2的[D/E]XXXL[L/I]模体序列串联起来。实验结果显示,其具有良好的抗病毒效果。综上所述,AP1复合体是HCV生命过程中必须的宿主因子,这些发现对阐明AP1复合体参与HCV感染过程的具体机制提供了有力的实验数据,为HCV抗病毒药物的研发提供了新的靶点。