基于蛋白质组与代谢组的肉鸡热应激分子机制研究1.pdf

基于蛋白质组与代谢组的肉鸡热应激分子机制研究
作者 : 唐湘方
学位授予单位 : 中国农业科学院
学位名称 : 博士
导师姓名 : 张敏红;张宏福
学位年度 : 2015
关键词 : 肉鸡；热应激；定量蛋白质组学；代谢组学；ERK1/2信号通路
摘要 : 热应激是现代肉鸡生产中普遍关注的关键问题,但机体的热应激分子调控机制尚不完全清楚。目前多数研究仅限于个别基因的功能表达或通路分析上。本研究通过构建肉鸡热应激模型,应用蛋白质组学和代谢组学高通量分析技术,在整体水平系统分析肉鸡热应激下体内蛋白质及小分子代谢产物组成的变化及其整体代谢通路,结合生物信息学方法,对肉鸡热应激分子机制进行深入研究。主要内容及结果如下:1、肉鸡热应激模型构建:选择21d健康AA雄性肉鸡144只,随机分成对照组(26±1℃)和持续高温组(32±1℃),每组72只,饲养至42日龄,测定体温、生产性能与血液生化指标。结果表明:在21-42d持续3周高温热暴露分别降低肉鸡的平均日增重60%(P<0.01)和平均日采食量42%(P<0.01),提高料重比46%(P<0.01);持续32℃热暴露72 h后,肉鸡体温显著升高(P<0.05),血液中TG显著降低(P<0.05),而LDL-C和GLU显著升高(P<0.05);持续32℃热暴露1周后,肉鸡体温显著升高(P<0.05),血液中AST和LDL-C水平显著升高(P<0.05),GLU和HDL-C增加达到极显著水平(P<0.01)。2、基于质谱的肉鸡肝脏蛋白质组鉴定方法研究:试验开始72 h时,在热应激模型试验肉鸡中随机抽取AA雄性肉鸡18只,对照组(26±1℃)和持续高温组(32±1℃)各9只进行屠宰取肝样用于蛋白质组鉴定和SWATH定量分析。结果表明,通过丙酮沉积、延长洗脱时间和质谱“分级”显著提高了鸡肝蛋白质的鉴定数量,实现在165min有效时间内一次鉴定到4271个蛋白及对应的36073条多肽,且50%以上的蛋白有超过5段的多肽被鉴定到,被鉴定到的蛋白分别参与糖类代谢、脂类代谢等328个重要代谢通路,该研究确定了适合鸡肝等复杂样品内的蛋白质鉴定策略。3、非标定量技术解析肉鸡肝蛋白的热应激响应机制:本研究利用高通量、非标记的SWATH定量技术,在鸡肝中成功鉴定到257个与热应激密切相关的蛋白,GO注释和通路分析表明,这些蛋白主要涉及机体氧化还原过程、蛋白质折叠、信号传导及负凋亡调控等生物功能,参与能量代谢通路、氨基酸代谢通路、脂类代谢通路和免疫调节相关的代谢通路。同时对GSTA2、NDUFA8、CYP3A7、FADS1和HSPA5五种蛋白质表达水平进行MRM和Western blotting验证,结果表明这5种蛋白的变化趋势与SWATH分析结果一致,证实了SWATH定量蛋白质组学数据可靠。4、基于代谢组学的肉仔鸡热应激分子机制研究:试验开始70-74 h时,在热应激模型试验肉鸡随机选择AA雄性肉鸡20只,对照组(26±1℃)和持续高温组(32±1℃)各10只收集粪样用于代谢组学分析。本试验建立了基于UPLC/MS的代谢组学分析粪样中代谢产物的方法,研究了肉鸡热应激与对照组的粪样中代谢谱差异,发现10个可能成为潜在的可有效区分肉鸡热应激组和正常组的生物标志物,这些标志物主要涉及糖酵解和糖异生作用、脂类代谢、氨基酸代谢等代谢途径。综合上述结果及国内外热应激研究进展,深入分析发现,热应激下肉鸡可能是通过以下途径缓解应激:1)抑制与磷酸化修饰相关的ERK1/2信号通路,调节细胞增殖、分化与凋亡修复热应激损伤;2)下调ACOT1和ACOT8表达,抑制脂肪酸合成;3)上调BHMT和下调GAMT表达促进蛋氨酸合成,清除应激生成的ROS;4)上调P2RX1和下调KIT表达提高神经酰胺水平,上调DDC和PAH和下调COMT表达,促进儿茶酚胺合成,提高神经兴奋以增强抗应激能力;5)上调HSP90AA1和LUM等表达,诱导肝细胞炎症反应和免疫应答,提高巨噬细胞的吞噬能力。通过研究筛选了参与热应激调控的关键蛋白和应激评价敏感指标,初步揭示了肉鸡热应激响应的相关调控网络,探讨了肉鸡对热应激的应答机理,为肉鸡环境应激早期预警、舒适度评价及其有效缓解提供理论基础。