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利用网络药理学方法探讨连夏宁心方治疗冠心病痰热证药理学机制的临床与基础研究
作者 : 杨阳
学位授予单位 : 北京中医药大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 李平
学位年度 : 2019
关键词 : 促肾上腺素释放激素；环氧化酶-2；冠心病；连夏宁心方；网络药理学；心房利钠肽前体蛋白A
摘要 : 连夏宁心方是治疗冠心病痰热证的中药复方。该方不仅可以治疗冠心病以及冠心病主要症状胸闷胸痛,而且对冠心病痰热证密切相关的冠心病合并疾病和合并症状都有明显改善作用。该方具有一般中药复方的治疗机制特点,即具有“多成分、多靶点、多通路”的特点。按传统方法从连夏宁心方相关的数千个药物靶点中一个接一个地确定连夏宁心方的作用靶点与机制是极其困难的。网络药理学研究药物对人体的作用考虑了人体的全部生物蛋白及其相互作用关系构成的复杂网络对药物靶点的影响作用,适合研究作用于多靶点的药物的作用机理。无尺度网络特征和疾病模块特征是复杂网络的基本特征。网络药理学常基于上述两大基本特征研究中药复方的作用机制。因此,本研究将基于网络药理学这两大分析方法分别研究连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机制和靶点,为人们更好理解连夏宁心方的治疗作用,推广连夏宁心方的临床应用提供依据。本论文主要由以下四部分组成:研究一文献研究综述了网络药理学在中药复方作用机制研究中的现状,分析了网络药理学的主要研究方法,中药复方作用机制网络药理学研究的基本研究模式、常用研究工具以及数据库,以及有代表性的研究案例。为本论文接下来要进行的对连夏宁心方作用机制的研究提供文献以及理论支持。研究二基于无尺度网络分析方法预测并验证连夏宁心方治疗冠心病后交感神经重构的作用靶点研究目的:交感神经重构是冠心病痰热证重要的冠心病合并疾病之一,该合并疾病的出现常引起冠心病患者发生恶性心律失常甚至发生心源性猝死。既往研究表明连夏宁心方对冠心病后合并交感神经重构有明显抑制作用。本研究基于无尺度网络的研究方法预测连夏宁心方治疗冠心病交感神经重构的作用靶点,并通过动物实验进行验证。方法:通过检索公开数据库和文献,建立连夏宁心方中药—组分—靶点对应关系复杂网络,即中药靶点数据库。利用无尺度网络分析法的定量指标“节点度”确定连夏宁心方的重要靶点。随后,根据文献研究,从无尺度网络分析方法确定的连夏宁心方的重要药物作用靶点中预测出对冠心病合并疾病交感神经重构有抑制作用的靶点。靶点确定后,通过基础实验验证这一预测结果。基础实验的具体研究步骤为将SD大鼠随机分为4组,分别为:假手术组(未结扎大鼠冠脉并予每日生理盐水灌胃)、心梗组(结扎大鼠冠脉并予每日生理盐水灌胃)、对预测靶点表达有阻断作用的西药阳性药物对照组(结扎冠脉并与每日西药灌胃)以及连夏宁心方组(结扎冠脉并予每日连夏宁心方中药灌胃)。所有大鼠干预30日后进行心率变异性检测、对心梗周边区进行TH免疫组化检测和预测靶点的Western Blot和qRT-PCR检测,根据统计学分析后的结果讨论无尺度网络分析方法预测结果的准确性。结果:根据无尺度网络分析方法和文献研究结果,环氧化酶-2(COX-2)被预测是连夏宁心方治疗心梗后交感神经重构的重要作用靶点。基础实验结果显示:连夏宁心方与环氧化酶-2抑制剂西药塞来昔布均明显降低了心梗周边区的交感神经分布;连夏宁心方和塞来昔布对心梗后大鼠心肌中的COX-2的蛋白水平和基因表达水平有明显衰减作用;连夏宁心方和塞来昔布都可以降低代表心脏交感神经张力的LF指标,提高代表总体心率变异性的TP指标。结论:网络药理学预测结果以及基础实验研究结果皆表明连夏宁心方是通过阻断COX-2的表达抑制心梗后交感神经重构的发生。研究三基于李平教授门诊病历探讨连夏宁心方治疗冠心病痰热证的典型合并疾病与合并症状的临床研究目的:连夏宁心方可明显改善的冠心病痰热证的冠心病合并疾病与合并症状可以反应连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机理。网络药理学通过研究这些合并疾病与合并症状可以确定连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机制。因此,本研究拟通过李平教授的门诊病历并结合既往关于连夏宁心方的研究基础确定连夏宁心方治疗冠心病痰热证有特异性疗效的冠心病合并疾病与合并症状,为下面的基于疾病模块分析法研究连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机制研究奠定基础。方法:以李平教授过往门诊电子病历记录为研究对象,对比冠心病痰热证病例与冠心病非痰热证病例的冠心病合并疾病与合并症状的分布情况,以及对比连夏宁心方治疗病例与非连夏宁心方治疗病例中药改善冠心病合并症状的差异,结合既往研究基础,确定连夏宁心方治疗冠心病痰热证的代表性合并疾病与合并症状。结果:冠心病痰热证组的合并症状失眠、心悸、口苦、心烦出现次数明显多于冠心病非痰热证,连夏宁心方治疗组对冠心病的合并症状心悸和头晕改善率明显高于非连夏心方治疗组。结论:结合既往研究结果,连夏宁心方治疗冠心病痰热证的典型合并疾病确定为自功能紊乱、心律失常、失眠症、焦虑症、交感神经重构;典型的合并症状包括胸痛、胸闷、气短、心悸、头晕、心烦、失眠、口干、口苦。研究四基于疾病模块分析法预测连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机制目的:基于前期关于冠心病模块的研究基础,利用疾病模块研究方法预测连夏宁心方治疗冠心病痰热证的药物作用机理。方法:基于研究二的研究基础,建立连夏宁心方中药靶点数据库;通过检索公开的生物信息数据库的基因信息,建立连夏宁心方具有明显改善作用的冠心病痰热证的合并疾病和合并症状的种子基因组(这些连夏宁心方治疗冠心病痰热证的合并疾病和合并症状是通过研究三确定的);利用模块富集分析法确定与合并疾病、合并症状基因组及中药种子蛋白靶点组均密切相关的关键冠心病基因模块;应用通路富集分析法(Pathway)、基因本体富集分析法(GO term)分析关键冠心病模块的功能;用最短路径分析法确定连夏宁心方分别在关键冠心病模块、合并疾病与合并症状中的重要靶点。结果:编号分别为146和203的两个冠心病模块与连夏宁心方合并病症、中药分别组成的不同种子蛋白组进行富集分析的结果中出现有统计学意义(P<0.05)结果的次数高于其它冠心病模块;Pathway与GO term功能分析结果提示146模块的G蛋白受体偶联信号传导通路与203模块的细胞蛋白代谢调节通路是各自所在模块的重要功能通路;最短路径分析法结果表明连夏宁心方在这两个冠心病模块上的关键靶点蛋白分别是组成各自模块的上述重要功能通路的蛋白分子;根据最短路径分析结果,促肾上腺素释放激素(CRH)与心房利钠肽前体蛋白A(NPPA)是仅有的连夏宁心方中药靶点蛋白分别与各自所在的冠心病模块、合并疾病与合并症状基因组中相对应的种子基因间平均最短路径长度均小于3的两个重要蛋白。结论:G蛋白受体偶联信号传导通路以及细胞蛋白代谢调节通路是连夏宁心方治疗冠心病痰热证的关键作用通路;CRH、NPPA是连夏宁心方治疗冠心病痰热证的重要靶点;连夏宁心方的中药生物信息库提示半夏对上述两个关键靶点有较强的直接调节作用。综合研究一结果分析,由于COX-2、CRH和NPPA都是炎症因子,因此,连夏宁心方治疗冠心病痰热证的作用机制与炎症反应密切相关。