水稻CCT家族基因功能验证，OsMADS3新等位基因突变机制的研究1.pdf

水稻CCT家族基因功能验证，OsMADS3新等位基因突变机制的研究
作者 : 张莉
学位授予单位 : 华中农业大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 邢永忠
学位年度 : 2015
关键词 : 水稻；CCT基因家族；候选基因；关联分析；突变体；雄性不育；广亲和；轮回选择
摘要 : 1.植物开花是一个受外界环境和内在基因共同调控的复杂过程,许多基因家族共同参与,形成调控网络。CCT基因家族基因参与调控植物开花。目前,水稻中41个CCT基因成员只有6个基因被证实调控开花。为更高效鉴定更多的CCT家族开花基因,本研究结合候选基因关联分析与连锁分析鉴定功能基因,通过转基因进行功能验证,并对其中一个CCT基因进行功能研究。研究结果如下:1.1候选基因关联分析与功能验证通过整合公共数据库的水稻开花期QTL信息,共得到59个水稻开花期QTLs,与水稻41个CCT基因的物理位置比较,发现有25个CCT基因位于QTL区间内。利用529份世界水稻种质资源对CCT家族基因与水稻抽穗期性状进行关联分析,共有19个CCT基因与抽穗期相关。我们选择了18个CCT基因进行转化验证,结果表明,8个关联基因落在QTL区间,有5个基因通过转基因验证确定调控开花;4个关联基因不在QTL区间,但有2个通过转基因验证与开花相关;6个既没关联到也不在QTL区间的基因都不参与水稻开花调控。1.2 CCT家族基因表达模式与核酸多样性根据基因所含功能结构域将CCT基因分为CMF亚家族,COL亚家族和PRR亚家族。在日本晴5个不同发育时期的叶片和茎秆中对CCT的35个基因进行了表达模式分析,发现三个亚家族的基因大部分都在叶片中表达丰富,部分基因在茎秆中也有较高的表达。41个CCT基因在529份栽培稻和107份野生稻中中共有4002个SNPs,CCT家族基因的平均核酸多样性π=2.7×10-3,多数CCT基因的核酸多样性在每1kb有1到8个SNPs。1.3 OsCCT01基因功能研究OsCCT01属于CMF亚家族,超量表达OsCCT01导致中花11在长日照下抽穗期延迟25天,短日照下延迟15天。抑制表达OsCCT01则没有出现抽穗期相关表型。通过检测光周期途径相关基因在超表达植株中的表达,发现OsCCT01是通过抑制Ehd1基因及其下游Hd3a和RFT1基因的表达而抑制开花。除了抽穗期的表型,OsCCT01同时出现株高变矮,分蘖减少,产量下降等发育相关表型,通过激素处理发现OsCCT01对BR响应显著,检测BR受体基因OsBRI1和BR信号传导途径上的相关基因在超量植株中的表达水平的变化,推测OsCCT01参与BR信号传导途径;检测了细胞周期基因在超表达植株中的表达量差异,结果表明3个G2/M期的基因在OsCCT01超表达阳性植株中明显下降。推测,OsCCT01可能处在细胞周期核心调控元件的下游调节细胞分裂。OsCCT01对植株发育的机制有待深入研究。2.作物遗传改良的基础是自然变异,自然变异是由自发突变形成。在构建重组自交系过程中,RI127发生自然突变成隐性雄性核不育系RI127S。通过图位克隆的方法鉴定出OsMADS3就是控制雄性不育的基因,该基因已有文献报道其调控花器官发育和雄性不育。利用交错式热不对称PCR分离到1633 bp序列插到OsMADS3基因内部,导致它不能正常转录而丧失功能。1633 bp序列来自第5染色体上一个反转座子的片段。分析OsMADS3在530份自然群体和107份普通野生稻中的核酸多态性,共有7种单倍型,98%的品种是都是H2类型,表明OsMADS3是功能特别重要的持家基因,在自然进化过程中必须高度保守,这与它决定雄性育性是吻合的。RI127S来自籼稻特青和广亲和品种02428杂交后代,携带02428的S5基因型。RI127具有优良的农艺性状和广亲和性,因此RI127S是轮回育种中一个好的中间体,省去轮回选择中品种间杂交的繁重人工去雄工作。RI127S既可以与籼稻杂交又可以与粳稻杂交,为育种家在轮回育种中提供灵活的方案。