急性肾衰竭大鼠血小板功能变化及机制研究

急性肾衰竭大鼠血小板功能变化及机制研究
作 者 : 姚光强
学位授予单位 : 华中科技大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 明章银
学位年度 : 2016
关键词 : 急性肾衰竭；甘油生理盐水；ARF大鼠；血小板；胶原；聚集；释放；CD62P；血小板活性；GPⅥ；GPⅢa；PKC；AKT；ERK1/2
摘 要 : 第一部分急性肾衰竭大鼠模型的建立【背景和目的】急性肾功能衰竭(acute renal failure,ARF)经常是地震、交通事故、矿难等重大灾难中人员死亡的主要原因之一。在这些事件中身体因受到严重碾压、重伤而引发挤压综合征,其中特别是以急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)为主并一系列与之相关的并发症最终导致了ARF的发生。到目前急性肾功能衰竭(ARF)的病死率仍然高达50%左右。如果可以让横纹肌溶解所致急性肾衰竭的发生率得到控制或降低,对大众健康和社会将会意义重大。本实验该部分首先建立并评估甘油导致急性肾衰模型,为后续实验做准备。【方法】模型组和对照组大鼠禁水24 h,期间不禁食,称重后于后二肢肌肉等量注射甘油生理盐水溶液(10 ml/kg),正常组大鼠注射生理盐水溶液(10 ml/kg),造模后72h取大鼠血浆,检测血浆Cr、BUN、P、K水平,并取大鼠肾脏做HE染色分析。【结果】和对照组比,模型组大鼠血浆中Cr、BUN、P、K水平明显增高,且肾组织切片HE染色提示模型组大鼠肾脏发生明显的病理性损伤。【结论】甘油生理盐水注射制作大鼠ARF模型可以引起其肾脏功能的急性下降,快速引起肾脏实质性损伤,模型制备成功。第二部分急性肾衰竭大鼠血小板功能变化研究【背景和目的】横纹肌溶解引起的肌红蛋白毒型的急性肾衰竭(Acute renal failure,ARF)占该病病例的10-40%,其中急性肾衰患者凝血功能出现显著性变化,一方面患者倾向于出现出血事件,另一方面又伴随着血栓性事件频发。血小板是凝血系统中一个重要角色,在生理性止血和病理性血栓过程中都是积极参与者,该实验研究了大鼠发生横纹肌溶解所致急性肾衰竭过程中血小板体外活性变化,旨在探索急性肾衰时血小板功能的变化情况。【方法】1.血细胞计数仪检测ARF和正常组大鼠全血中血小板数目差异。2.用血小板聚集仪比较模型组和正常组血小板在低高剂量激动剂:ADP、Collagen、CRP和Thrombin刺激下聚集活性的区别。3.用血小板聚集检测仪检测两组血小板在Collagen(1μg/ml)诱导下ATP释放的差异。4.流式细胞术检测两组血小板在静息和激动(Thrombin,0.1 U/ml)状态下P-selectin(CD62P)表达的差异。【结果】1.在急性肾衰竭情况下大鼠全血中血小板数目和正常组相比没有发生显著性改变。2.在激动剂Collagen、CRP、Thrombin的低剂量激动剂刺激下模型组洗涤血小板聚集能力明显强于对照组,而高剂量下没有区别;在低高剂量ADP刺激下模型组PRP(platelet-rich plasma)聚集能力均高于对照组且有显著性差异;且由Collagen引起的两组洗涤血小板的ATP释放也存在显著性差异。3.在Thrombin刺激下,流式细胞术检测到两组血小板在激动前后其P-selectin表达并不存在显著性差异。【结论】大鼠在急性肾衰竭情况下,大鼠血小板聚集和释放致密颗粒的能力均比正常组强,而释放α-颗粒的能力没有改变;第三部分大鼠急性肾衰时血小板活性变化机制研究【目的】研究大鼠发生ARF时血小板功能变化情况下,血小板表面受体表达及胞内信号蛋白分子磷酸化水平相对于正常对照组的改变情况,探索其功能变化机制。【方法】制取ARF和正常组大鼠洗涤血小板,用Collagen(2μg/m L)刺激血小板活化,选择在0s、90s、180s时将其裂解,采用Western blot技术检测两组血小板膜GPⅥ表达水平及胞内蛋白PKC底物(p47)、AKT(Ser473)、ERK1/2(E4)磷酸化水平,并用流式细胞术检测在Thrombin(0.1U/ml)刺激前后两组血小板表面受体GPⅢa(CD61)的水平差异。【结果】Western bloting结果显示在刺激0s、90s、180s时,模型组血小板其表面GPⅥ水平和胞内PKC底物(p47)、AKT(Ser473)、ERK1/2(E4)信号蛋白磷酸化水平均较正常组显著增高,同时流式细胞术检测结果表明模型组血小板在静息和激动状态下GPⅢa(CD61)表达水平也显著性增高。【结论】大鼠急性肾衰时其血小板活性增高的原因可能与表面受体GPⅥ和GPⅢa的表达上调及下游信号蛋白分子磷酸化水平增高有关。

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