高分子纳米载药系统的设计及其抗肿瘤研究
作 者 : 杨胜彩
学位授予单位 : 吉林大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 张文科
学位年度 : 2019
关键词 : 纳米药物；化疗；肿瘤；刺激响应；缺氧；联合治疗
摘 要 : 临床广泛使用的小分子抗肿瘤药物常常存在靶向性差、体内循环半衰期短、利用率低、毒副作用大等多种问题。与传统小分子化疗药物相比,基于高分子载体的纳米药物在治疗癌症方面具有以下优势:改善药物溶解性、延长循环时间、基于EPR效应的被动靶向能力、毒副作用低等。基于实体肿瘤微环境特征,本论文以生物相容性高以及生物可降解的高分子材料为基础,设计了简单有效的纳米药物载体,用于小分子化疗药物的体内传输。同时,本论文基于药物对肿瘤微环境的调控,研究了不同抗肿瘤药物之间的联合治疗效果,希望能够克服实体肿瘤治疗过程中存在的问题。本论文的研究内容和主要结论如下:(1)我们制备了pH和氧化还原双响应的生物可降解聚多糖材料Dex-SA-L-Phe-L-Cys并通过非共价相互作用担载阿霉素盐酸盐(DOX·HCl),得到双响应的纳米载药粒子DOX-S-NPs。并且,在水溶液(无任何有机试剂)中通过调节溶液pH值实现DOX·HCl的无毒、安全、有效的担载,材料上丰富的羧基与阿霉素的氨基的静电作用以及苯丙氨酸提供与阿霉素之间强的π-π堆积的疏水作用,同时半胱氨酸的巯基氧化形成二硫键来稳定纳米药物的组装,防止纳米粒子在血液循环中解体。DOX-S-NPs在生理条件下具有稳定的纳米结构,但在酸性(pH5.5)和还原性(20.0 mM谷胱甘肽)条件下可快速释放药物。激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)和流式细胞分析同时证实,DOX-S-NPs和小分子药物DOX·HCl具有相当的细胞内吞能力。体外细胞毒性实验也证实,DOX-S-NPs和DOX·HCl具有相似的肿瘤细胞生长抑制作用。在体内抑瘤实验中,DOX-S-NPs和DOX·HCl具有相似的抗肿瘤效果,但纳米药物的毒副作用更小、体重毒性更低。该纳米药物的设计思想对于智能型纳米药物载体的设计具有重要的借鉴意义。(2)为了解决药物体内半衰期短、药物溶解性差等问题,我们通过化学共价相互作用开发了结构简单可控的高分子键合药。首先制备了聚(L-谷氨酸)接枝聚乙二醇(PLG-g-mPEG)作为主体材料,然后分别通过酰胺或酯化反应将吉西他滨(GEM)或双氢青蒿素(DHA)键合到高分子材料上,得到水溶性良好的高分子键合药GEM-NPs和DHA-NPs。利用CLSM、流式细胞、蛋白质印迹法(Western Blot)和免疫细胞分析,在细胞水平证实小分子DHA和纳米药物DHA-NPs都能够诱导活性氧自由基(ROS)生成,从而促进血红素氧化酶-1(HO-1)的过度表达,进而抑制肿瘤细胞胞苷脱氨酶(CDA)的表达。更重要的是,在肿瘤组织中过度表达的CDA能够促进GEM失活形成非活性代谢物dFdU,是GEM利用率低和药效差的主要原因。在人卵巢癌A2780细胞上,细胞毒性证实了DHA+GEM以及GEM-NPs+DHA-NPs的体外协同作用,得到了最佳的药物摩尔比(DHA/GEM,10/1,mol/mol)。细胞凋亡实验证明,DHA+GEM(或GEM-NPs+DHA-NPs)联合治疗组细胞凋亡显著高于单独给药治疗组。该联合用药的设计研究为其联合用药原理提高了可靠的解释。(3)缺氧敏感前体药物(HAPs)具有选择性杀伤缺氧细胞,将肿瘤缺氧从劣势转化为选择性治疗优势的潜力。然而,由于肿瘤的缺氧水平不足以激活HAPs发挥细胞毒性,大多数临床实验均以失败告终。本论文中我们提出了一种将HAPs与血管阻断剂(VDA)纳米药物联合用于实体瘤治疗的新策略。首先,通过化学共价相互作用合成了聚(L-谷氨酸)接枝聚乙二醇/康普瑞汀纳米药物(CA4-NPs)。CD31染色、光声成像(PA)和缺氧免疫荧光染色等实验证实了CA4-NPs能够破坏肿瘤血管、诱导肿瘤缺氧,为HAPs激活提供了可能性。细胞毒性实验显示代表性HAPs替拉扎明(TPZ)能够在缺氧环境中表现出更高的细胞杀伤能力。在转移性4T1乳腺癌模型中,当肿瘤起始治疗体积为180 mm~3时,CA4-NPs和TPZ联合治疗能够完全清除肿瘤,同时抑制肿瘤远端转移。更重要的是,大多数人类肿瘤只有在其体积大到足以被发现时才会被发现,有效地对抗大体积肿瘤的策略具有临床意义。当肿瘤起始治疗体积为500 mm~3时,小鼠肺和肝的H&E结果显示,4T1已经发生远端转移,但是CA4-NPs+TPZ联合治疗显著收缩肿瘤并抑制肿瘤生长,同时肺喷墨实验证明能够抑制肿瘤远端转移。该体系为HAPs和VDAs的联合策略提供了可靠的支持,对治疗大体积肿瘤提供了新的治疗思路。(4)基于肿瘤微环境的缺氧特征,首先制备了缺氧敏感的药物载体材料聚(L-谷氨酸)接枝聚乙二醇/偶氮苯(PLG-g-mPEG/AAB),利用π-π堆积的疏水相互作用物理担载伊立替康(CPT-11)得到缺氧敏感纳米药物CPT-11-NPs。CPT-11-NPs在生理条件下具有稳定的纳米结构,但是在缺氧的硝基还原酶作用下能够水解。CLSM和流式细胞分析同时证实,CPT-11-NPs和小分子药物CPT-11具有相当的细胞内吞能力,并且缺氧环境对纳米粒子的内吞影响不明显。体外细胞毒性实验也证实,无论缺氧还是常氧条件下,CPT-11-NPs和CPT-11具有相似的肿瘤细胞生长抑制作用。同时,体内抑瘤实验表明CPT-11-NPs的毒副作用明显小于小分子药物。由于CA4-NPs可以诱导肿瘤缺氧水平升高,因此能够促进缺氧敏感的CPT-11-NPs释放CPT-11,发挥抗肿瘤效果。本论文中,将CA4-NPs和CPT-11-NPs的联合治疗策略用于治疗4T1肿瘤,而且体内抑瘤实验表明该联合用药策略和单独用药方式具有显著的优势。通过本论文的研究,希望能够设计简单有效的高分子载体解决小分子抗癌药物体内传输的问题,为纳米药物在治疗中存在的问题提供参考和思路,为纳米药物的临床应用奠定基础。
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