TRB3连接Insulin/IGF信号促进肿瘤发生发展的作用和机制

TRB3连接Insulin/IGF信号促进肿瘤发生发展的作用和机制
作者 : 余娇娇
学位授予单位 : 北京协和医学院
学位名称 : 博士
导师姓名 : 胡卓伟
学位年度 : 2016
关键词 : TRB3；糖尿病；肿瘤；p62；自噬；泛素蛋白酶体系统；蛋白质-蛋白质相互作用；Pep2-A2
摘要 : 糖尿病是一组以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,其发病率在全球范围内逐年递增。糖尿病及其所导致的各种急、慢性并发症严重威胁人类健康。近年来,流行病学与临床研究证据表明,糖尿病增加多种肿瘤的患病风险并提高其死亡率。事实证明,糖尿病与肿瘤拥有一系列共同的代谢危险因素,包括高胰岛素、高胰岛素样生长因子1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1)、高血糖、糖剥夺、缺氧以及炎症因子等。这些因素被认为是连接糖尿病与肿瘤的重要节点。其中,高胰岛素与高胰岛素样生长因子1被认为是导致糖尿病人群肿瘤高发的主要危险因素,但具体机制仍不甚清楚。TRB3 (tribbles homolog 3)是一种压力和代谢应激蛋白,与肿瘤发生、发展密切相关。实验室前期研究结果显示,TRB3通过与信号分子Smad3相互作用促进TGF-β介导的肿瘤细胞侵袭及转移。鉴于TRB3可以感知各种代谢和应激信号,参与糖、脂代谢的调节,高表达TRB3引起胰岛素抵抗。我们提出研究假说,TRB3连接代谢应激,促进肿瘤发生和发展。在本课题中,我们发现TRB3与磷酸化的胰岛素受体底物-1 (phosphorylated insulin receptor substrate 1, pIRS-1)在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织,并且TRB3和pIRS-1表达与肿瘤不良预后呈正相关。此外,糖尿病中普遍存在的代谢因素如高血糖、高胰岛素血症、高IGF-1等均能诱导TRB3表达增高。高表达的TRB3介导Insulin/IGF-1引起的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)产生,诱导DNA损伤,促进肿瘤生长和转移。这些研究结果表明,TRB3确实介导了Insulin/IGF-1的促肿瘤作用。自噬在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用,由此我们进一步研究了TRB3与自噬间的关系。在人支气管上皮细胞BEAS-2B上过表达TRB3,降低Ⅰ型LC3向Ⅱ型的转化,促进可溶性和不可溶性自噬“货车蛋白”p62堆积。而敲低肿瘤细胞中TRB3不仅能降低基础水平的可溶性和不可溶性p62堆积,还能解除由IGF-1引起的p62增高。由此提示,TRB3介导由IGF-1引起的p62堆积和自噬抑制。继而,我们用mRFP-GFP-LC3报告基因检测自噬流,并且在电镜下观察细胞内自噬体及自噬溶酶体的形成情况,同样发现TRB3介导IGF-1引起的自噬抑制,敲低TRB3可使自噬流恢复通畅。实验室早期研究发现,TRB3与自噬“货车蛋白”p62存在相互作用,相互作用的位点位于p62的LC3相互作用结构域(LC3-interacting region, LIR)和泛素结合结构域(ubiquitin-associated domain, UBA)。TRB3通过与LIR及UBA的相互作用阻碍p62与LC3以及与泛素化蛋白间的结合,抑制p62功能,进而抑制自噬。我们后续的研究也发现TRB3和p62在肝癌、结肠癌、肺癌组织表达都显著高于正常肝脏、结肠和肺组织,而且在这些肿瘤组织中,TRB3与p62之间存在相互作用,可溶性和不可溶性p62堆积,自噬流受到抑制。探索TRB3介导Insulin/IGF-1引起p62堆积的具体机制,我们发现TRB3主要通过增加p62蛋白稳定性,促进p62堆积。大量堆积的p62不仅能抑制自噬,还能进一步引起泛素蛋白酶体降解系统障碍。自噬与泛素蛋白酶体系统双重障碍将导致一系列促肿瘤蛋白,包括EGFR、COX-2、MMP-1、MMP-2、 MT-MMP、c-Myc、Twist等在细胞中堆积,进而促进肿瘤发生、发展。鉴于TRB3-p62相互作用在诱导肿瘤细胞自噬阻滞中发挥的关键作用,实验室前期通过Biacore技术筛选出一段能与TRB3结合的α螺旋肽Pep2-A2,并证明这段多肽能干扰TRB3与p62之间的相互作用。我们进一步检测了Pep2-A2调节自噬、抑制肿瘤的活性。结果显示,Pep2-2解除TRB3与p62间结合,能恢复p62功能,使其重新与LC3及泛素化蛋白结合,进而活化自噬以及泛素蛋白酶体功能,促进EGFR、 COX-2、MMP-1、MMP-2、MT-MMP、c-Myc、Twist等促肿瘤蛋白降解。动物实验结果进一步证实,Pep2-A2确实具有抑制肿瘤生长和转移的作用。综上所述,我们的研究证明TRB3是连接糖尿病和肿瘤发生、发展的关键桥梁。糖尿病中普遍存在的高胰岛素血症、高IGF-1能诱导TRB3表达。高表达的TRB3与自噬“货车蛋白”p62相互作用,抑制自噬流,进而引发泛素蛋白酶体系统障碍。自噬和泛素蛋白酶体系统双重障碍导致EGFR、COX-2、Snail等一系列促肿瘤蛋白堆积,促进肿瘤发生、发展。靶向TRB3/p62相互作用的α螺旋肽Pep2-A2具有抗肿瘤活性。我们的结果阐明了糖尿病人群肿瘤高发的分子机制,并证明TRB3/p62相互作用可能是潜在的肿瘤治疗靶点,为开发具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物奠定了理论和物质基础。