促抗原溶酶体逃逸的肿瘤纳米疫苗的研究

促抗原溶酶体逃逸的肿瘤纳米疫苗的研究
作 者 : 刘晓璇
学位授予单位 : 北京协和医学院
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 刘兰霞
学位年度 : 2018
关键词 : 抗原；溶酶体；逃逸；肿瘤
摘 要 : 目的:通过激活自身免疫系统识别并清除肿瘤细胞的肿瘤免疫疗法成为近年来临床上治疗恶性肿瘤的一项新策略。随着纳米科技的发展,纳米颗粒介导的疫苗即纳米疫苗已成为越来越重要的一个研究领域。纳米颗粒除了可以保护所载抗原免受体液中各种酶的降解及作为抗原储存池的作用外,还可以通过靶向修饰将抗原精准地输送至免疫细胞。近几年来,研究证实通过时空控制编排,借助纳米颗粒还可以改变抗原在免疫细胞内的递呈通路,诱导产生特定的免疫反应,如促进纳米疫苗负载的抗原从溶酶体逃逸至胞浆后通过MHC-Ⅰ途径提呈即交叉呈递,激活抗原特异的细胞毒性T细胞免疫反应。本研究分别将具有跨膜作用的细胞穿透肽MPG△NLS和具有干扰溶酶体膜稳定性作用的羟基氯喹HCQ引入纳米疫苗中,以增强抗原从溶酶体逃逸至胞浆中通过交叉呈递,诱导机体产生抗原特异的细胞免疫反应,尤其是细胞毒性T淋巴细胞反应。方法:MPG△NLS介导的纳米疫苗是首先将细胞穿膜肽MPG△NLS与模型抗原OVA以二硫键共价连接,然后采用两步乳化法将其包裹在PLGA纳米颗粒中制备而成(MPG△NLS-OVA-PLGANPs);HCQ介导的纳米疫苗是采用PLGA直接包裹HCQ与OVA的混合物制备成纳米颗粒(HCQ-OVA-PLGANPs)。然后对纳米粒的形貌和理化性质进行表征;采用BCA法测定纳米粒蛋白包封率和模拟环境下的体外蛋白释放情况;通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒在树突状细胞(DC)的摄取与分布;采用流式细胞术和ELISA分析纳米粒对DC的促成熟作用;最后,用MPG△NLS-OVA-PLGA NPs/HCQ-OVA-PLGA NPs免疫小鼠后进行血清抗体ELISA分析、脾免疫细胞流式分析来研究疫苗的体内抗肿瘤效果。结果:本研究成功制备了 MPG△NLS-OVA-PLGA NPs和HCQ-OVA-PLGA NPs两种可促进抗原溶酶体逃逸的纳米疫苗,该纳米粒的粒径约为200～250 nm,呈相对均匀的球形;纳米颗粒的抗原包封率达70%,且具有良好的缓释效果;体外研究表明该纳米粒均可有效地被DC摄取,MPG△NLS和HCQ均可显著提高纳米疫苗中抗原的溶酶体逃逸率,并能显著增加DC表面协同刺激分子的表达及促进Th1型细胞因子IL-12、TNF-α的分泌,表明MPG△NLS或HCQ的引入纳米疫苗均有利于促DC细胞成熟和活化作用,并有利于诱导产生Th1型免疫反应。动物实验结果显示,应用MPG△NLS-OVA-PLGA NPs和HCQ-OVA-PLGA NPs免疫后,可显著提高小鼠血清中抗原特异性IgG水平,尤其可提高IgG2a/IgG1的比值,表明MPG△NLS和HCQ均倾向于诱导Th1型免疫反应的产生;脾内免疫细胞流式结果显示,纳米疫苗可显著促进分泌IFN-γ的T细胞的增殖,尤其显著提高了 IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例,进一步证实MPG△NLS和HCQ可显著促进T细胞免疫反应的强度,尤其细胞毒性T细胞免疫反应,并能产生有效的记忆T细胞免疫应答,有效延缓肿瘤生长和提高荷瘤小鼠生存期。结论:本课题成功构建了促进抗原溶酶体逃逸和交叉提呈的的两种纳米疫苗体系,负载MPG△NLs-OVA的PLGA纳米疫苗和HCQ介导的OVA的PLGA纳米疫苗。两个纳米疫苗均能增加抗原提呈细胞对抗原的摄取和交叉提呈,促进DC成熟和活化,诱导产生较强的抗原特异性免疫反应,尤其是CTL,并可诱导产生较强的免疫记忆。本课题纳米疫苗体系的成功构建,为肿瘤治疗提供一种经济高效、制备简单、副作用小、给药可控的免疫治疗手段,同时可为其它疾病纳米疫苗的设计提供理论指导。

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