非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的初步研究
作 者 : 彭彬
学位授予单位 : 四川农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王印
学位年度 : 2014
关键词 : 非洲猪瘟；pK205R蛋白；抗体；ELISA
摘 要 : 非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性传染病,强毒株感染导致死亡率达100%,尚无理想的疫苗问世。该病尚未在我国发生,但随着贸易往来越来越密切,该病对我国的威胁随之加剧,因此建立对应的实验室诊断方法十分必要。本研究利用分子生物学方法表达非洲猪瘟病毒的pK205R蛋白,为建立快速、灵敏、特异性的血清学诊断方法奠定了基础。研究取得以下结果。1、非洲猪瘟病毒K205R基因的扩增根据已发表的K205R基因序列设计引物,以人工化学合成的含K205R基因的质粒为模板,扩增K205R基因,将其插入pMD-18T载体中进行测序,所获序列与已发表的ASFV-K205R（GenBank ID:NC001659.1）完全相同。2、非洲猪瘟病毒K205R基因在大肠杆菌中的克隆表达用BglⅡ、NotⅡ将含有K205R基因的重组质粒pMD18T-K205R和载体pET-32a双酶切后,回收、纯化、连接构建成原核表达质粒,命名为pET32a-K205R。将重组质粒pET32a-K205R转化到大肠杆菌BL21 （DE3）,经IPTG诱导其表达pK205R蛋白,运用SDS-PAGE鉴定表明pET32a-K205R在大肠杆菌中高效表达,以可溶的形式存在,表达产物分子量约为44.0KD。制备的兔免血清抗体效价达1：512000。以兔免疫血清进行Western blotting,检测显示抗血清可与pK205R蛋白发生特异性反应,说明本实验原核表达的pK205R蛋白具有良好的反应原性,可以作为检测ASF特异抗体的抗原。利用重组蛋白所带的6xHis标签,用HisTrap FF层析柱进行蛋白纯化,获得纯度较高的重组蛋白。3、建立ASFV间接ELISA抗体检测方法以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,通过对抗原最适包被浓度、血清最适稀释度、抗原包被条件、封闭液种类、酶标二抗最适稀释度、血清最适作用时间、酶标二抗最适作用时间、底物显色时间的优化,确定最适工作条件。结果显示,抗原最适包被浓度6.5μg/mL、血清最适稀释浓度为1：320、抗原包被条件37℃包被1h后转4℃包被过夜、封闭液选择1%BSA、酶标二抗的最适稀释度为1：4000、血清和酶标二抗最适反应时间均为60min、底物显色最适时间为15min。4、非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒组装和质量评价利用建立的间接ELISA抗体检测方法,研制非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒,并对试剂盒的特异性、敏感性、重复性、保质期进行研究。结果表明,试剂盒在特异性方面,与标准阳性血清呈阳性反应,而与猪瘟（HC）、猪伪狂犬（PR）、猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）、副猪嗜血杆菌（Hps）、猪大肠杆菌（E.coli）和猪沙门氏菌（SB）6种疾病的阳性血清均无交叉反应；敏感性方面,当标准阳性血清稀释到1：5120时,检测结果小于临界值,建立的ELISA方法敏感性良好；重复性方面,批内、批间重复实验变异系数均不超过10%。试剂盒在4℃条件下保存4个月后检测结果基本一致。
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下载参考地址：
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非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的初步研究1.pdf
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