非洲猪瘟病毒K205R基因的原核表达及金标试纸的初步研制
作 者 : 刘波
学位授予单位 : 四川农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王印
学位年度 : 2014
关键词 : 非洲猪瘟病毒；K205R基因；原核表达；胶体金试纸条
摘 要 : 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的急性传染病,以急性高热为特点,伴有全身及全身内脏器官出血,猪群一旦感染,发病率和死亡率均可达到100%,被OIE列为通报疫病。ASF的临床表现与猪瘟极其相似,极易造成误诊,目前我国尚无ASFV,要严格防范,对相关的进口产品快速诊断和监测是防止本病传入我国的关键技术之一,本试验运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术,对ASFV快速检测试纸条的技术进行了初步研究。首先本试验运用原核表达系统制备了ASFV K205R基因的表达蛋白：利用人工合成技术获得含有ASFV K205R基因的pMDTM19-T Simple载体,经NotⅠ、BgiⅡ限制性内切酶酶切获得K205R基因片段；将pET32a质粒经Not I、BgiⅡ限制性内切酶双酶切回收目的产物,并与K205R基因进行连接,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,结果显示重组原核表达系统pET32a-K205R质粒构建成功；将重组质粒pET32a-K205R转入表达载体BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达后,可在大约44 kDa处获得特异性蛋白条带,并优化确定了37℃、1 mmol/L IPTG、诱导表达3 h为最佳诱导条件。SDS-PAGE分析显示重组菌株所表达的K205R基因蛋白主要分布在菌液上清中,且表达量远大于其他菌体表达蛋白。经Ni-TED亲和层析法得到K205R纯化蛋白,通过免疫家兔制备抗ASFV K205R蛋白的血清,ELISA结果显示所获得的K205R纯化蛋白能与阳性血清反应,说明纯化蛋白具有免疫原性。利用柠檬酸三钠还原法制备不同直径大小的胶体金颗粒,肉眼观察胶体金溶液澄清透明,无可见漂浮物,紫外分光光度计扫描结果显示,100 ml 0.01%氯金酸溶液中加入2.2 ml 1%柠檬酸三钠溶液所制备的胶体金颗粒均匀,此时制备的胶体溶液为酒红色,直径在10 nm-20 nm,可用于标记蛋白。根据胶体金免疫层析的原理,本试验用兔抗K205R抗体标记金颗粒并作为金标垫,用兔抗K205R抗体作为检测线(T线)捕获K205R蛋白,用葡萄球菌A蛋白(SPA)作为质控线(C线)；经过对工作条件的优化,确定金标兔抗K205R抗体的最佳标记量为40 μg/ml,最佳p H值为7.5,T线抗体浓度为1.5 mg/ml,C线SPA浓度为2 mg/ml 。经检测,所研制的胶体金试纸条能与表达K205R蛋白反应,不能与BL21大肠杆菌裂解液、猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒(PCV)等反应,对K205R表达蛋白的最小检测量大约为30 ng/ml-40 ng/ml。
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