RABV感染小鼠脑组织蛋白质组学分析及自噬与RABV复制关系研究

RABV感染小鼠脑组织蛋白质组学分析及自噬与RABV复制关系研究
作者 : 李岭
学位授予单位 : 吉林大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 夏咸柱
学位年度 : 2017
关键词 : 狂犬病；狂犬病病毒；蛋白质组学；细胞自噬；病毒复制
摘要 : 狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染引起的一种急性、高致死性中枢神经系统(CNS)疾病。该病病原RABV属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员。据世界卫生组织(WHO)统计,全球范围内每年约有59,000人死于狂犬病,且绝大多数病例发生在亚洲、非洲等发展中国家。目前,我国的狂犬病死亡病例仅次于印度,位列世界第二。对RABV的研究已逾百年,但关于其致病机理仍无明确定论。有关RABV与宿主细胞相互作用方面的了解还很有限,特别是RABV感染后引起的宿主蛋白质整体变化水平及与之相关的失调的生物学功能整体研究进展较为缓慢。另外,目前对不同毒力的RABV致病性差异的机制研究主要集中在病毒蛋白本身序列或结构上的差异,鲜有研究从宿主角度入手考虑与致病性差异有关的宿主相关因子的群体变化水平。近年来同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定量蛋白质组学技术由于其高通量、高敏感性及定量准确性等特点被越来越多的应用到病毒感染蛋白质组学研究中。联合生物信息学的手段对差异表达蛋白进行系统的表达模式、功能聚类和参与的生物学通路及相关作用网络进行分析,能够快速筛选出与病毒感染或机体防御等功能密切相关的宿主反应因子。因此,对RABV感染的小鼠脑组织蛋白表达谱进行定量分析对揭示RABV致病机理具有重要的指导意义。自噬是机体进化保守的一种胞内降解途径,能够将衰老的细胞器、有害的蛋白聚集体、错误折叠蛋白等包裹至自噬体中,并通过与溶酶体融合实现内容物的降解。自噬是细胞维持自身稳态的重要生物学进程,亦是细胞应对外界刺激和微生物感染的重要途径,如营养缺乏、氧化应激、病毒感染等。多项研究表明病毒感染可以影响细胞自噬活性,如水疱性口炎病毒(VSV)、猪瘟病毒(CSFV)等的感染均可以诱导宿主细胞自噬。相反的,自噬也可以通过多种途径影响病毒的感染,如自噬可以对水疱性口炎病毒的核酸进行加工并递送至toll样受体(TLRs)识别从而刺激干扰素(IFN)的产生实现自噬的抗病毒作用。然而,多种病毒已进化出逃避、对抗甚至利用自噬为自身感染提供便利的策略,如登革热病毒可以利用自噬过程降解甘油三脂从而加速ATP的产生为自身复制提供能量。在我们的课题开始之初尚无RABV与自噬相互作用的报道,因此研究二者关系可为解析RABV致病机理提供重要依据。本研究利用i TRAQ LC-MS/MS定量蛋白质组学技术对RABV标准攻击毒株CVS-11感染后及RABV强、弱毒株感染后的小鼠脑组织蛋白表达谱进行比较分析,对筛选出来的差异表达蛋白进行生物信息学分析,挖掘出显著相关的生物学通路——自噬,且在细胞水平上完成验证,并对自噬对RABV感染的影响进行初步探索。本研究主要分为以下四个部分:第一部分:RABV强毒株感染小鼠脑组织蛋白表达谱分析。本研究利用i TRAQ LC-MS/MS定量蛋白质组学技术对RABV标准攻击毒株CVS-11感染后1、4、7天的小鼠脑组织进行蛋白表达谱分析。结果共鉴定到2,781个非冗余的宿主蛋白,经定量分析后显示共有104个宿主蛋白在感染后的3个时间点上出现差异表达,其中感染后1天有23个蛋白上调,17个蛋白下调;感染后4天有16个蛋白上调,17个蛋白下调;而感染后7天,有40个蛋白上调及16个蛋白下调。生物信息学分析显示,差异蛋白主要与细胞骨架、免疫应答、应激反应、信号转导、能量代谢等功能相关。其中值得注意的是干扰素诱导GTPase家族成员干扰素诱导GTP酶M家族蛋白(IGRM)1、鸟苷酸结合蛋白(GBP)2、干扰素诱导GTP酶(IIGP1)、γ干扰素诱导GTP酶(IGTP)的表达量较未感染组明显升高,且除GBP2外差异表达均具有连贯性。因此,选取8种已明确报道的与病毒感染相关的干扰素诱导GTPase家族成员进行转录水平上的验证,结果显示其表达水平均呈时间依赖性增强。通过进一步的筛选发现多种干扰素诱导GTPase均与自噬通路密切相关,由此确定自噬为该研究接下来探讨的重点。第二部分:RABV强、弱毒株感染小鼠脑组织蛋白表达谱比较。为探索RABV强、弱毒株之间致病性差异的宿主相关因子,该部分实验分别选取标准攻击毒株CVS-11株与实验室致弱毒株SRV9株分别作为RABV强、弱毒株的代表,对两者感染后1、4、7天的小鼠脑组织进行定量蛋白质组学分析,结果发现以未感染组小鼠脑组织蛋白表达谱为背景,标准攻击毒株CVS-11感染组在3个时间点共鉴定到90个差异蛋白,而弱毒株SRV9的感染在3个时间点共鉴定到227个差异蛋白,表明弱毒株可诱导更广泛的宿主蛋白谱变化。由于该部分实验的主要目的是筛选RABV强、弱毒株间致病性差异的宿主相关因子,因此着重针对以SRV9感染后小鼠脑组织蛋白表达谱为背景鉴定到的差异蛋白进行生物信息学挖掘。通路分析结果显示,差异蛋白主要靶向自噬及其相关通路,如自由基清除、核因子E2相关因子2(NRF2)-介导的氧化应激等。对生物信息学结果进行总结发现,自噬处于RABV感染的中心位置,发挥承上启下的作用。该部分实验强有力的提示自噬可能参与RABV感染过程,因此确定自噬与RABV感染的关系做为接下来研究的目标。第三部分:RABV感染对NA细胞自噬活性的影响。本研究第一和第二部分的RABV感染蛋白质组学分析均提示细胞自噬可能参与RABV感染过程,因此第三部分实验将回答RABV感染是否影响细胞自噬水平这个问题。该部分实验中,选取小鼠神经瘤(NA)细胞为体外模型,通过透射电镜观察自噬体的超微结构、荧光显微镜观察EGFP-LC3荧光斑点的聚集情况,并联合应用western blot方法检测自噬标记分子LC3-II和自噬底物p62的表达量等多种手段评估RABV强、弱毒株感染后NA细胞的自噬水平。结果显示,RABV感染NA细胞后,胞内自噬体数量明显增多,且实验室致弱毒株SRV9诱导的自噬体的增多明显高于标准攻击毒株CVS-11株。综上所述,RABV感染可以诱导自噬,且强、弱毒株之间存在差异。第四部分:细胞自噬对RABV复制及致病性的影响。首先利用细胞增殖和毒性检测试剂盒CCK-8测定自噬调节剂处理后NA细胞的活性及利用RABV内化实验测定自噬调节剂对RABV内化速率的影响,从而筛选出适用的自噬激动剂及抑制剂。接下来在RABV感染过程中以自噬调剂处理NA细胞,测定自噬活性改变对RABV复制的影响。此外,为排除药物对细胞其他方面的非特异性影响,利用sh RNA对自噬关键基因Beclin 1进行沉默后检测下调自噬水平对RABV复制的影响。结果显示,调节细胞自噬对RABV在NA细胞上复制无影响。另外,该部分实验亦对自噬调节剂对RABV在小鼠脑组织内复制及对小鼠的致病性影响进行检测。体内实验结果表明,自噬激动剂可以在不影响病毒复制的情况下增强RABV对小鼠的致死性。