动物微生物学实验指导.pdf

实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色

实验 2 细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察

实验 3 微生物细胞形态及菌落特征观察

实验 4 培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术

实验 5 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数

实验 6 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数

附录 1 常用培养基配方

附录 2 常用染色液的配制

附录 3 常用试剂和指示剂的配制参考书目

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实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

1、学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；

2、学习显微镜油镜观察的方法；

二、实验内容

1、细菌的简单染色；

2、细菌的革兰氏染色；

三、实验原理

简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。

四、实验材料

1、活材料：培养 12～16h 的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养 24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。

2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。五、实验用品废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有 75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等。

六、实验方法

（一）简单染色

1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液 2～3 环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取 2～3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有其它方法？

3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2～3 次固定，以不烫手为宜。★为什么要进行该步骤？

4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色 1～2min。

5、水洗：水洗去涂片上的染色液。

6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。

7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？
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