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脂肪间充质干细胞移植治疗兔眼角膜碱烧伤疗效及作用机制研究
作者 : 李颖
学位授予单位 : 南方医科大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 陈晓
学位年度 : 2015
关键词 : 脂肪间充质干细胞；移植；羊膜；碱烧伤
摘要 : 研究背景眼表损伤是全世界范围内致盲的主要原因之一,其中,最常见的原因是眼化学性烧伤(如碱、酸烧伤)和热烧伤,这类损伤对眼表的损伤重,治疗困难,预后较差,常导致伤眼失明,甚至丧失眼球。角膜碱烧伤在化学性烧伤中最严重,主要是因为碱性物质的皂化反应会导致角膜组织液化坏死,后续引起的免疫炎症反应比较容易向深层发展,并造成角膜溃疡和穿孔、继发性青光眼及并发性白内障,严重破坏眼的解剖结构和视功能。目前,对于严重的碱烧伤尚无有效的治疗手段。角膜移植是仍然是主要治疗手段,但是,角膜移植存在取材困难、远期植片存活率低、移植术后排斥反应等诸多困难,限制了其应用和疗效。除了角膜移植手术外,其他的手术治疗方法还包括：①自体角膜缘干细胞移植。自体角膜缘干细胞移植不存在免疫排斥反应,移植片成活率很高,解决了供体来源不足的缺点,而相对于健眼,干细胞的部分缺失不会对正常的眼表功能造成影响,因此自体角膜缘于细胞移植术已经成为一种临床上日益成熟和比较可靠的治疗方法之一,而且在角膜缘干细胞移植手术中成功率最高,对一部分患者有较好的效果。然而,由于严重角膜碱烧伤患者,自体角膜移植常需要较大的移植块,且取自健侧眼,从健眼取多少角膜缘组织才能保证既不影响健眼的眼表稳定,又有效地治疗患眼,仍然是一个没有解决的问题。此外,对于双眼均发生大面积眼表损害的伤者,就没有可供移植的自体角膜缘干细胞；②异体角膜缘移植,虽然能提供足够的角膜缘植片,但来源受限,限制了它的应用。不容忽视的是,由于该方法供体角膜缘具有丰富的毛细血管,缺乏免疫赦免其移植后的排斥反应常常较重；③羊膜移植,由于羊膜取材丰富、是一种目前在临床上广泛应用的方法,但对于角膜碱烧伤等重度角膜损伤的患者,由于羊膜的透明度比角膜差,即使移植成功,角膜也不能恢复到原来的透明度,疗效仍不佳。角膜碱烧伤是最严重的角膜化学损伤,碱性物质既能溶于脂肪又能溶于水,能迅速与细胞中的脂类物质发生皂化反应,其形成的化合物既能很快穿透亲水的角膜基质,又能迅速穿透亲脂的结膜、角膜上皮和内皮,可造成角膜缘干细胞的严重破坏。角膜缘干细胞的严重缺失会导致持续的炎症反应,角膜结膜上皮化生,新生血管的长入及角膜基质的瘢痕化。近年来,随着对角膜缘干细胞的生物学特性的研究,相继出现了角膜缘干细胞移植术、羊膜移植术和培养的角膜缘干细胞移植等治疗手段。干细胞的研究,干细胞与组织工程的结合为眼表疾病的治疗提供了一种新的思路,有希望用于治疗角膜碱烧伤的于细胞主要有以下几种：1.胚胎干细胞：胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是一种来源于早期胚胎内细胞团和尿生殖嵴的多潜能干细胞,可以在特定条件下诱导分化成三个胚胎层的所有细胞[4]。Ahmad等以角膜缘成纤维细胞为基质,通过Ⅳ型胶原蛋白铺板,成功将ESCs诱导分化成角膜上皮样细胞,Homma等将ESCs诱导分化成的角膜上皮样细胞移植到角膜损伤的小鼠模型上,24小时内观察到角膜上皮的再生。这些结果表明ESCs具有诱导分化成角膜上皮细胞的潜能。然而,由于ESCs涉及伦理学问题及具有致瘤的潜在风险,因而限制了其进一步研究及运用。2.骨髓间充质干细胞：具有增殖能力强,且分化多潜能性,在体外培养的环境中,不同诱导条件下可以定向地分化为心肌细胞、上皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、成骨细胞等不同细胞。此类细胞来源明确,重点是避免了胚胎干细胞可能面临的伦理学问题,并且因为是自体组织来源,所以排斥反应的发生率很低,具有较好的应用前景。目前,已有研究将体外培养的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植于兔碱烧伤模型,探讨MSCs治疗眼表损伤的可能性,也取得了获得了较好的效果。近年来,更有报道指出：将鼠MSCs与鼠角膜基质细胞(corneal stromal cells, CSCs)共同培养,可以成功诱导分化为具有角膜基质样细胞特征的细胞,将之移植于鼠碱烧伤模型,对于眼表重建有良好的疗效。但是,由于骨髓细胞成分复杂,分离较困难,干细胞含量极低获取数量有限,限制了其在临床的的广泛应用。3.脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs):与MSCs在生物表型及功能类似,实验证实同样具有多方向分化的潜能。体外实验发现,ADSCs在不同条件下,可以诱导分化为不同组织细胞,例如血管内皮、心肌、软骨、神经、脂肪等细胞。由于人体脂肪组织含量丰富,远远大于骨髓组织,容易获取,克服了MSCs来源不足的缺点,因此越来越受到亲睐。但是,由于ADSCs的纯化问题仍未得到很好的解决,同时绝大部分实验停留在动物实验及细胞表型的分化研究阶段,其分化成某种成熟的细胞表型后是否依然具有相应的细胞功能及通过哪些细胞信号传导通路发生关键作用仍未清楚,利用ADSCs移植治疗眼表损伤的研究国内外报道甚少。对于角膜碱烧伤的病理机制,近年研究已经取得了一定的进展。角膜碱烧伤是一个复杂的病理过程,涉及到多种细胞及分子的参与,除了碱性物质直接损伤作用外,免疫系统的参与也起着至关重要的作用。在错综复杂的免疫炎症网络中,免疫炎性细胞(包括淋巴细胞、多形核白细胞、朗格罕斯细胞等)和免疫分子(如细胞因子、趋化因子、黏附因子、等)相互影响及作用,介导角膜碱烧伤的病理变化。干细胞移植是如何发挥治疗作用的,目前研究尚存在很多未解决的问题。本研究拟采用新西兰白兔,首先在体外分离培养ADSCs以及CSCs,通过transwell小室共培养诱导,将ADSCs诱导成为具有角膜基质样细胞特征的细胞,最后以羊膜为载体,移植到兔角膜碱烧伤模型中,观察移植术后角膜形态学的恢复情况以及初步探讨其作用机制。期望诱导成功后的ADSCs能够通过降低血管内皮生长因子的表达及抑制相关免疫炎症因子的表达来有效的减少新生血管的形成及生长,减轻角膜混浊而显示其治疗效果。同时,初步探索ADSCs治疗角膜碱烧伤的作用机制。本课题从以下四个方面进行研究后得到以下结果和结论：第一部分：兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)的分离培养及鉴定目的建立ADSCs体外分离、培养及扩增的体系,证实脂肪组织中确实存在有多向分化潜能的干细胞,为ADSCs移植治疗角膜碱烧伤提供一定的理论基础。方法采用酶消化法分离兔腹股沟脂肪组织,10%胎牛血清的DMEM培养基培养,酶消化法消化传代扩增,通过细胞形态学及流式细胞仪鉴定ADSCs的特殊表型。结果脂肪组织来源的间充质干细胞形态学上以成纤维梭样生长,贴壁成单层排列。流式细胞鉴定CD34(-),CD45(-),CD105(+),CD29(+),CD44(+),阳性率分别为90.23%、88.56%、98.88%。结论脂肪组织中可以成功分离培养出具有干细胞特性的细胞群,其具有强大的增殖力,其生物学表面标记为表达CD29,CD44干细胞特征,不表达CD34,CD45等造血细胞特异性表面分子,有望成为组织工程细胞种子的来源。第二部分：体外ADSCs与CSCs共培养诱导向角膜基质样细胞分化目的共培养诱导脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)向角膜基质样细胞(corneal stromal cells,CSCs)分化,为进一步研究ADSCs移植治疗角膜碱烧伤的疗效及分子机制奠定基础。方法在transwell共培养系统(孔径0.45 μm)中共培养ADSCs和CSCs, ADSCs置于下层,1周后使用keratin-pan荧光染色及RT-PCR鉴定诱导后细胞是否向角膜样细胞标志物keratin-pan表达。结果共培养诱导后1周,keratin-pan mRNA RT-PCR鉴定诱导后细胞向角膜基质细胞分化(标志物keratin-pan表达阳性)。结论ADSCs在体外一定条件下可以诱导分化为角膜基质样细胞,也为进一步研究ADSCs移植治疗角膜碱烧伤奠定理论基础。第三部分：脂肪间充质干细胞移植治疗兔角膜碱烧伤疗效的临床观察目的观察兔脂肪间充质干细胞移植治疗角膜碱烧是否可以提高治疗效果。方法将符合碱烧伤模型标准的60只新西兰白兔随机分为4组(各15只)：A组为已诱导ADSCs+羊膜,B组为ADSCs–羊膜,C组为单纯羊膜移植,D组为未治疗组。术后1周、2周、1月测量新生血管面积,对角膜混浊程度进行评分,比较4组的临床疗效。结果移植后,角膜混浊程度评分及新生血管面积在术后1周、2周、1月时,四组之间存在差异两两比较均有统计学差异(P<0.05),且A组角膜混浊程度评分及新生血管面积在3个时间点均明显小于其它3组。结论ADSCs移植治疗能明显降低碱烧伤后新生血管形成,改善角膜混浊状态,提高透明度,促进角膜碱烧伤后组织损伤的修复。第四部分：脂肪间充质干细胞移植治疗兔角膜碱烧后对相关因子浓度的影响目的检测脂肪间充质干细胞移植治疗兔角膜碱烧后是否对角膜及房水中相关因子的浓度有影响。方法术后1个月处死4组新西兰兔,取其房水及角膜组织样品,使用ELISA法测定移植术后房水中VEGF的含量变化及角膜组织中炎症相关因子IL-10、CD-45、 IFN-γ含量,观察4组的因子浓度改变。结果移植术后1月,ELISA法测定CD45、IL-10、IFN-γ浓度在4组之间,两两比较均有统计学差异(P<0.01),CD45、IFN-γ浓度在A组明显低于其它3组,IL-10浓度A组明显高于其它3组；而VEGF浓度在4组之间两两比较,除外C、D组(P=0.525),其它均有统计学差异,且A组明显低于其它3组(P<0.01)。结论ADSCs移植治疗碱烧伤的作用机制可能是其在一定条件下分化为具有角膜细胞特征的细胞,同时降低免疫炎症反应及抑制新生血管形成等因素的作用。