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TF-MPs促进肿瘤相关高凝状态作用机制的探讨
作 者 : 米小昆
学位授予单位 : 河北医科大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 单保恩;桑梅香
学位年度 : 2017
关键词 : 肿瘤；高凝状态；隐匿性梗死；组织因子；微粒；乳腺癌
摘 要 : 肿瘤患者常常合并急慢性动静脉血栓事件,严重影响患者生存质量。早在1856年Trousseau第一次描述了肿瘤相关系统性血栓栓塞事件,之后将肿瘤合并游走性静脉炎统称为Trousseau’s syndrome。随着人们对这一病症的了解,它所涉及范围已涵盖所有癌症高凝状态(Cancer Associated Hypercoagulability,CAH)动静脉血栓栓塞病症。高凝状态使患者处于易栓体质,易发生下肢静脉血栓栓塞(Venous Thromboem Bolism,VTE)、肺栓塞(Pulmonary Embolism,PE)、弥散性血管内凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)等并发症,极大影响了肿瘤患者的生存率。同时,这种异常的高凝背景又进一步加速肿瘤细胞的生长以及播散,它可以使循环中的肿瘤细胞更容易沉淀下来,发生局部种植;并且,活化的血小板在肿瘤细胞周围形成血小板包衣,使肿瘤细胞逃避NK细胞免疫攻击。肿瘤患者体内的凝血状态的激活与炎症、血栓、肿瘤进展、转移等之间形成互相关联、互相促进的网络。所以,对肿瘤高凝状态的正确认知以及及时有效的预防治疗,对提高肿瘤患者生活质量起着至关重要的作用。在众多肿瘤高凝状态观察研究中,以VTE、PE为主要研究范围,对于神经系统动脉栓塞关注较少。一个尸检报告结果显示15%的癌症死亡患者存在明确病理诊断的卒中,但只有大约一半的患者生前被发现临床症状的卒中。与传统脑卒中相比,肿瘤合并缺血性卒中的患者预后更差,有更长的住院时间。目前为止,对这类患者的早期发现、早期治疗等措施仍不明确。神经科医师经常会遇到无明确病因的隐匿性梗死,这些隐匿性梗死的发病率大约为20-46%,人们尝试认为未明肿瘤引起的高凝状态可能是这类隐匿梗塞的病因之一,若能明确其背后隐藏致病机制,将会使这部分患者得到及时有效的治疗及二级预防,很大的提高患者生活质量。目前临床中针对肿瘤高凝的预防多采用肿瘤静脉血栓栓塞事件防治专家共识,然而,由于条件限制等原因,未能全面推广;又由于肿瘤患者血栓防治涉及多学科,循证医学资料多而庞杂,缺少系统归纳;另外尽管血栓预防的概念已经被普遍接受,但缺乏针对肿瘤患者血栓防治的循证医学,因而限制了肿瘤患者血栓防治的工作。目前,专家共识中针对血栓预防的纳入标准主要来自风险评估量表,缺乏量化、标准化的血液检测指标指导临床防治,所以,急切需要类似血管病危险因素(血脂、血糖、尿酸等)的血液测量指标来帮助临床发现血栓事件发生的高危人群,及时给予预防治疗,从而提高患者生活质量及生存率。关于肿瘤高凝状态的发生机制研究中常被提到的相关因素有:组织因子(Tissue Factor,TF)、微粒(Micro-particles,MP)、癌促凝物质(Cancer Pro-coagulant,CP)等。组织因子是其中重要的生物活性物质,它可以与微粒相结合成组织因子微粒(Tissue Factor-positive Microparticles TF-MPs)而发挥作用。在实体肿瘤、血液肿瘤研究中发现,患者体内组织因子微粒含量高于非肿瘤患者,但并未阐明升高的TF-MPs是肿瘤高凝状态的产生原因还是伴随高凝产生的结果。动物实验研究发现,在动物体内注入人肿瘤细胞产生的TF-MPs可产生类似DIC样反应、血小板骤降,提示其有可能是引起高凝的原因之一。TF-MPs结构包含TF、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine PS),二者共同发挥促进凝血作用,使肿瘤患者出现凝血功能异常。对于易栓体质人群来说,早期及时预防治疗至关重要。然而,目前临床上没有一项能够很好的预测血栓事件发生的客观检测指标,TF-MPs作为肿瘤患者体内异常增高促凝物质一直处于研究领域的热点,但其是否可以作为评估肿瘤患者血栓事件发生的预测指标目前仍没有定论。综上所述,我们推测肿瘤高凝状态是肿瘤合并神经系统血栓栓塞事件发病机制之一,尤其对于隐匿性梗死;而TF-MPs升高则诱导肿瘤患者处于高凝易栓状态。TF-MPs能否客观反映临床高凝状态的程度取决于其是否能够起到促进高凝发生。为了验证这些问题,我们首先分析了神经系统传统脑梗死(cerebral infarction,CI)与肿瘤合并脑梗死两类患者人群的临床综合特征,分析肿瘤高凝在隐匿性脑梗死发生中的作用;观察肿瘤患者体内血浆TF-MPs水平的变化,探索其促凝活性以及促凝作用机制,评价血浆TF-MPs作为评价高凝的化验指标可行性。主要研究结果如下:第一部分肿瘤高凝状态诱导神经系统动脉血栓事件的临床观察目的:探讨肿瘤患者合并神经系统血栓栓塞事件的临床特征以及肿瘤高凝在隐匿性梗死中的作用。方法:1根据急性期脑梗死是否伴有活动期肿瘤病史分为肿瘤相关梗塞组(实验组)和单纯脑梗死组(对照组)。两组各58例患者,对两组患者临床特征、血液化验指标、影像学资料等进行单因素比较分析。然后以梗死类型诊断为因变量,单因素分析中P小于0.10的因素为自变量进行logistic多因素回归。2为避免肿瘤与卒中独立并存对结果的影响,对实验组进一步分析,进行亚组分析,将58例肿瘤患者进行根据Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST)分型标准分为两组,即隐匿性脑梗死组(Stroke of other undetermined etiology,SUE)和传统血管病组(Conventional stroke etiology,CSE)。SUE组患者由于除肿瘤病史外未发现任何梗死危险因素,所以视为肿瘤诱导梗死,CSE组发病机制为传统血管病机制诱导梗死。同样对两组患者进行临床资料综合分析,进一步剖析肿瘤高凝状态在隐匿性梗死中的作用。3应用流式细胞学技术对亚组中所有患者进行血浆TF-MPs测量,在SUE与CSE组间进行比较,并且与D-二聚体进行相关分析。结果:1实验组患者中隐匿性卒中比例、多区域梗塞比例、D-二聚体指标均高于单纯梗塞组患者(P<0.01)。2回归分析结果显示:D-二聚体(<0.3)、APTT、影像学特点为影响梗死类型诊断的独立因素,D-二聚体(<0.3)越高,为肿瘤合并脑梗死的可能越大,OR(95%CI)为10.474(2.588~42.390);APTT越高,为肿瘤合并梗死的风险越小,OR(95%CI)为0.780(0.671~0.906);影像学特点为多流域梗死的为肿瘤诱导梗死的可能越大,OR(95%CI)为11.055(2.390~51.130)。3亚组分析结果显示,SUE组患者远处转移发生率、外周血D-二聚体水平、多流域梗死发生率均明显高于CSE组患者(P<0.01)。4 SUE组患者的外周血的组织因子微粒(TF-MPs)含量为42.50(27.25~51.25)/μl,CSE组患者的TF-MPs为18.50(13.25~24.00)/μl,SUE组患者高于CSE组患者,差异有统计学意义(Z=5.413,P<0.001)。5实验组所有患者的血浆TF-MPs与D-二聚体水平呈正相关,相关系数r=0.477,P<0.001。结论:1肿瘤高凝状态是隐匿性脑梗死的发病机制之一。2肿瘤高凝诱导脑梗死具有不同于传统脑梗死的临床特征,表现为多流域梗死灶、血浆高D-二聚体、伴活动期肿瘤病史。当伴有肿瘤病史的脑梗死患者伴有血浆D-二聚体升高、多流域梗死时,提示其可能为高凝所致并采取有效的防治措施。3肿瘤诱导脑梗死患者体内血浆TF-MPs水平高于传统血管病患者水平,TF-MPs可能与高凝相关。第二部分乳腺癌患者外周血TF-MPs水平与高凝状态关系的研究目的:分析乳腺癌患者外周血浆TF-MPs水平、高凝状态水平的变化,评估亚临床高凝在乳腺癌患者人群的情况以及其与TF-MPs相关关系。方法:将87例首次在河北医科大学第四医院乳腺中心住院的乳腺癌患者(TNM分期I期10例,II期16例,III期32例,IV期29例;8例为原位癌,15例为导管型乳腺癌,64例为侵袭性癌症)作为实验组,20例良性乳腺病患为对照组。1分两组患者的常规凝血相关指标包括(凝血酶原时间PT、活化部分凝血酶时间APTT、纤维蛋白原FIB、D-二聚体)。2为更加明确患者体内促凝功能,对所有患者进行凝血酶生成实验(Calibrated automated thrombogram,CAT),分析实验组与对照组患者体内高凝状态的差异(分析指标为Peak、ETP、lag-time、tt Peak)。3应用流式细胞学技术测定所有研究对象的血浆TF-MPs水平,比较实验组与对照组、不同分期乳腺癌患者间的水平差异;在不同肿瘤病理分型间比较水平差异。评估测量TF-MPs对诊断或鉴别诊断的临床价值。4将患者外周血TF-MPs与凝血相关指标(凝血酶原时间PT、活化部分凝血酶时间APTT、纤维蛋白原FIB、D-二聚体、Peak、ETP、lag-time、tt Peak)进行相关分析,探讨TF-MPs与高凝指标之间相关关系。结果:1与对照组患者比较,实验组患者的PT、APTT时间缩短,FIB、D-二聚体数值增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2凝血酶生成实验结果显示:实验组患者lag-time(2.352±1.274min)短于对照组(3.582±2.330min),P<0.05;实验组患者Peak(434.97±159.28nmol/L)高于对照组Peak(354.10±144.11nmol/L),差异具有统计学意义,P<0.05;实验组患者ETP nmol/l.min(2586.41±964.44)高于对照组患者(2036.00±1133.47),差异具有统计学意义,P<0.05;实验组患者tt Peak(3.383±1.699min)短于对照组患者(6.182±3.541min)具差异具有统计学意义,P<0.05。3实验组患者随着Peak、ETP肿瘤分期的增高而升高,伴随侵袭性的增加而升高,lag-time、tt Peak伴随侵袭性的增加而缩短P<0.05。4实验组患者的血浆TF-MPs水平(76.69±18.89)明显高对照组(57.58±12.97),P<0.001,TF-MPs水平伴随着肿瘤分期增高而升高P<0.001,伴随侵袭性的增加而升高P<0.05。5相关分析结果显示患者血浆中TF-MPs与PT(r=-0.328,P<0.05)、APTT(r=-0.393,P<0.05)、lag-time(r=-0.426,P<0.05)、tt Peak(r=-0.411,P<0.05)呈负相关关系,与FIB(r=0.421,P<0.05)、D-二聚体(r=0.473,P<0.05)以及Peak(r=0.389,P<0.05)、ETP(r=0.381,P<0.05)呈正相关关系。结论:1乳腺癌患者普遍存在亚临床高凝状态,即未出现临床症状的异常高凝状态。2随恶性肿瘤分期的增加高凝状态倾向、血浆TF-MPs出现相应升高,随侵袭性增加,高凝状态倾向、血浆TF-MPs出现相应升高。3血浆TF-MPs水平与患者高凝状态存在明确的正相关关系。第三部分乳腺癌细胞来源组织因子微粒促进高凝的机制目的:明确乳腺癌细胞来源TF-MPs的促凝功能以及对其机制的探讨方法:经过PCR、Western-blot方法检测,在乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549、MDA-MB-453、MCF-7四种细胞中筛选高表达TF(实验组)、低表达TF(对照组)的细胞株进行微粒及促凝活性检测。1常规培养实验组、对照组两种乳腺癌细胞,培养成功后留取培养液待进一步流式检测。2将5×106个乳腺癌细胞悬浮于0.5ml的PBS中,经过摇床温育、离心等物理刺激作用使细胞发生机械破碎产生TF-MPs,进一步离心得到乳腺癌细胞来源TF-MPs的PBS混悬液,对其进行流式以及促凝功能检测。3应用流式细胞技术对TF-MPs的PBS混悬液及细胞培养液进行定性、定量分析,设定条件为:PE标记抗人组织因子抗体阳性、Annexin-FTIC阳性,直径小于1μm,符合上述条件认为是TF-MPs。测量五次取平均值,在两组间进行比较。4促凝功能测定:应用一期凝固法(one-stage clotting assay)对来源于5×106两种细胞的TF-MPs混悬液进行促凝功能(procoagulant activity PCA)测定,比较两组PCA差异。5促凝机制验证:1)应用梯度容量稀释的方法使5管相同TF-MPs的PBS混悬液中含有不同剂量(100、50、25、12.5、0μg/ml)的组织因子单克隆抗体(Monoclonal anti-human tissue factor,a TF)、膜联蛋白-V(Annexin-v),它们分别封闭TF-MPs表面的TF和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS),分析不同剂量a TF、Annexin-v封闭TF和PS后PCA下降的变化。2)应用同样梯度容量稀释的方法,将PBS代替a TF和Annexin-v加入待测TF-MPs混悬液中,将测得的PCA与加入a TF、Annexin-v后的PCA进行比较进一步明确TF和PS对PCA的影响。结果:1 PCR、Western-blot检测显示四种细胞株中MDA-MB-231组织因子表达水平最高,其次为MDA-MB-453、MCF-7、BT549。选择MDA-MB-231作为实验组,MCF-7作为对照组2在实验组、对照组两种细胞培养液检测结果中发现MDA-MB-231细胞培养液检测到符合条件的TF-MPs,12.80±1.04/μl,MCF-7细胞培养液中未检测到TF-MPs。3经过对MDA-MB-231与MCF-7两种细胞摇床温育、离心等物理刺激后,流式细胞学检测证实上述物理刺激可以产生符合设定条件的TF-MPs。高表达TF的MDA-MB-231细胞产生的微粒(55.80±1.64/μl)明显高于低表达组织因子的MCF-7细胞(10.40±1.14/μl)P<0.01。4促凝功能测定结果显示,MDA-MB-231细胞来源TF-MPs混悬液的PCA(220.84±2.20)明显大于MCF-7细胞组来源TF-MPs混悬液的PCA(36.13±0.85)P<0.01。5在MDA-MB-231细胞来源TF-MPs的PBS混悬液中加入不同剂量的a TF,PCA水平随加入a TF浓度的增加而下降,与未加入a TF的混悬液比较具有统计学差异,P<0.05。当加入TF单抗量的增加至50μg/ml后,PCA未再出现明显下降P>0.05,提示在a TF到达50μg/ml时,PCA被最大抑制,再增加a TF剂量对PCA无继续影响,其结果接近PBS的PCA58.49±1.23,说明TF-MPs的促凝活性主要来源于TF。6应用同样梯度容量稀释的方法,将PBS代替a TF加入待测TF-MPs的PBS混悬液中测得PCA,与加入a TF组比较,不同浓度a TF的PCA均低于不同浓度PBS的PCA,P<0.05,TF在TF-MPs的促凝活性中发挥着重要作用。7在MDA-MB-231细胞来源TF-MPs的PBS混悬液中加入不同剂量Annexin-V后,PCA水平随加入Annexin-V浓度的增加而下降,与未加入Annexin-V的TF-MPs混悬液比较均具有统计学差异P<0.05。8 Annexin-V量的增加至50μg/ml后,PCA未再出现继续下降,再增加剂量对PCA无继续影响。但与a TF不同,此时PCA活性仍高于PBS的PCA,P<0.05,说明TF-MPs的PCA部分来源于PS。9应用同样梯度容量稀释的方法,将PBS代替Annexin-V加入待测TF-MPs混悬液中测得PCA,与加入Annexin-V组比较,Annexin-V实验组中不同浓度的PCA均低于PBS组不同浓度的PCA,P<0.05,PS在TF-MPs的促凝活性中发挥作用。结论:1乳腺癌细胞来源的TF-MPs具有显著的促凝活性。2 TF-MPs发挥促凝机制主要依赖于微粒表面的TF、PS结构,并且TF在促凝中起着主导作用,PS起辅助作用。3乳腺癌细胞可以自发向周围介质释放TF-MPs。4乳腺癌细胞产生TF-MPs量的多少与细胞膜表达TF量的多少有关。

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