猪源重组抗体表达方法的建立

猪源重组抗体表达方法的建立
作者 : 王香玲
学位授予单位 : 中国农业科学院
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 李曦
学位年度 : 2014
关键词 : B淋巴细胞；猪源重组抗体；RT-PCR
摘要 : 猪伪狂犬病(pseudorabies, PR)是OIE规定的必须通报的疫病,给许多国家的养猪业造成巨大的经济损失。PRV可以感染许多动物,包括反刍动物、食肉动物、和啮齿动物,但是猪是该病毒的天然宿主。野猪被认为是家畜和人类几种疾病的储存库,包括古典猪瘟(CSFV)和非洲猪瘟(ASFV),猪圆环病毒2型(PCV2),猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV),猪细小病毒(PPV),戊型肝炎病毒(HEV),猪流感病毒等(Meng et al.,2009;Gortazar et al.,2002;Ruiz-Fons et al.,2008)。欧洲野猪和野生猪是PRV的持续储存库,因此野猪对家猪的威胁持续存在(Van der Leek et al.,1993).猪伪狂犬病的防治主要是通过接种疫苗。但是,当猪群爆发伪狂犬病时,注射疫苗已经无济于事。而此时,猪群的免疫力下降,很容易继发其他病毒和细菌的混合感染,造成严重的经济损失。因此我们要寻找新的防治猪伪狂犬病的方法。近几年来,抗体治疗在人类方面已经普遍应用。逐渐地,在动物方面,抗体治疗也引起一些科学家的关注。伪狂犬gB糖蛋白在疱疹病毒糖蛋白中非常保守,而且,gB糖蛋白在引起保护性免疫反应中起到了非常重要的作用。近几年,细胞分离技术广泛应用于免疫学的研究。B细胞以及记忆B细胞广泛分布于猪外周血中。而且,通过分离外周血中的B细胞来扩增抗体可变区和恒定区,从而形成重组抗体的研究已经成为热点技术。基于这一试验方法的启发,设计出了本实验的实验思路。本实验通过免疫SPF巴马猪伪狂犬活疫苗,免疫后每周采集抗凝血,并将采集的血液分离淋巴细胞,利用APC荧光标记的gB蛋白和FITC荧光标记的抗猪IgG抗体来标记分离的外周血淋巴细胞,从而锁定分泌抗gB蛋白IgG抗体的B淋巴细胞,利用RT-PCR技术将靶B细胞中的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增出来。连接T载体测序之后,利用NCBI数据库检索序列的同源性,同源性很高的序列大部分是猪的抗体可变区序列。利用IMGT-V/QUEST软件分析序列,扩增出的可变区序列分为4个框架区(FR) FR1-FR4,和三个高变区(CDR) CDR1-CDR3,符合抗体可变区的结构分布,这说明我们扩增出了猪源的抗体可变区序列。为了将抗体重链全长和轻链全长连接起来构成重组抗体,首先我们利用融合PCR将扩增出的重链可变区(VH)和本实验室保存的猪源抗体重链恒定区序列进行连接,将轻链可变区和本实验室保存的猪源抗体轻链恒定区序列进行连接,将连接起来的重链全长和轻链全长同样利用融合PCR,通过linker序列连接起来,构建成H-Linker-L序列,并将该序列连接到原核表达载体pET-28a,测序正确之后进行原核表达。利用western-blot首先初步鉴定原核表达的猪源抗体是否和HRP标记的兔抗猪IgG二抗反应,结果显示原核表达的抗体确实和兔抗猪IgG二抗反应。这说明我们构建的重组抗体确实为猪源抗体。本实验中,我们扩增并重组得到了猪源抗体,并且通过western-blot初步鉴定该重组抗体确实可以和HRP-兔抗猪IgG反应,该重组抗体确实为猪源的重组抗体。还需进一步验证该重组抗体在体外和体内的抗病毒作用,以期为猪伪狂犬病的防治奠定一定的基础。