7种猪病病原多重PCR检测技术的初步研究

7种猪病病原多重PCR检测技术的初步研究
作者 : 任梅渗
学位授予单位 : 四川农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王印
学位年度 : 2017
关键词 : 7种猪疫病病原；毛细管电泳分析系统；多重PCR检测方法
摘要 : 伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and.respiratory syndrome virus,PRRSV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)以及胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)在养猪业中是几种主要的烈性传染病病原,引发数种猪传染病,对世界养猪行业产生严重的影响并带来巨大的经济损失。本试验为实现同时对以上7种病原进行快捷、灵敏、准确的检测,分别使用普通多重PCR与毛细管电泳多重PCR进行检测技术的初步研究。(1)7重PCR方法的建立:引物设计针对7种病原的保守基因设计了 7对特异性引物用于扩增各病原保守区段的靶基因,分别为PRVgB、CSFVE2、ASFVP72、PRRSV M、HPS 16S rRNA、PM PLPE 以及 APP OMLA 基因。通过对多重 PCR 退火温度、反应条件与程序、引物浓度的优化,建立能够同时对以上七种病原进行检测的多重PCR方法。以50-58℃进行梯度PCR扩增以优化退火温度,使用10-1到10-8稀释倍数的标准品进行扩增,检测该方法的灵敏性。以该方法进行特异性检测,对照样品选择除了以上七种病原之外的常见猪病病原,包括乙脑病毒、细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。以7种病原DNA或cDNA随机混合作为模板进行扩增以检测该方法交叉反应性。使用该多重PCR方法对62份临床病料进行检测,进行国标或行业检测方法的平行检测,评价该方法的检测结果的符合率。结果显示:该方法最优的退火温度为51 ℃。在7重条带均出现的前提下,该方法对标准品的检测灵敏性为104copies/μL。所有对照样品的检测结果均为阴性,不同引物与模板相互之间在扩增时也没有出现交叉反应性。以该方法对67份临床病料进行检测,结果检出单重病原感染样品44份,多重感染病原14份,阴性样品5份,阳性率为86.6%,符合率为94%。(2)基于毛细管电泳多重PCR检测方法的建立:分析各病原标准毒株参考序列,针对各保守序列分别设计7对特异性引物,在每条引物的5’端加上通用引物标签序列,构成特异性嵌合引物。以50-60 ℃进行梯度PCR扩增以优化退火温度,使用正交试验进行特异性嵌合引物浓度的优化。取107 copies/μL-10-1 copies/μL浓度梯度的标准品进行检测,评价该方法的灵敏性。选取7种病原的基因组DNA或反转录产物cDNA,进行随机分组作为模板进行扩增,检测交叉反应性。以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪乙脑病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等其他重要病原的DNA或cDNA进行扩增,评价该方法的特异性。使用梯度稀释的7重混合样品(106-104 copies/μL)进行扩增,每个稀释度进行三次扩增,根据相对荧光强度,PCR产物浓度以及产物长度(bp)计算出相应的变异系数,以评价该方法的重复性。结果显示:该方法的最优退火温度为58.3 ℃,对七种病原进行同时检出的检测限度为103 copies/μL,各种对照样品均出现了特异性峰值,并且所有的阴性对照样品均未扩增,也未出现交叉反应性,相对荧光强度,PCR产物浓度以及产物长度检测的变异系数分别为2.93%,3.69%以及0.11%,三次重复试验之间数据差异变化微小,其变异系数均小于5%。临床样品的检测结果中,该方法对67份临床样品检测的结果,单重感染样品检出44份,多重感染样品检出18份,阴性样品5份,阳性率为92.5%。与国标或行业检测标准的检测结果完全一致,符合率为100%。结果表明:本研究建立的两种多重PCR方法能快速同时地检测7种主要猪疾病病原,具有良好的特异性、敏感性。为临床诊断和国内外动物检疫提供了快速、灵敏、特异、科学可靠的检测工具和技术储备。